非发酵菌及检验

第二十章不发酵菌及检验（不发酵G-杆菌）本章内容概述假单胞菌属（一）铜绿假单胞菌（二）嗜麦芽窄食单胞菌不动杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、莫拉菌属军团菌属不发酵菌概述不发酵或仅氧化形式利用葡萄糖的革兰阴性无芽胞杆菌；大部分为专性需氧菌。

包括13个属。

大多为条件致病菌。

除不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及个别假单胞菌外，氧化酶试验均为阳性。

氧化-发酵（O-F）试验是确定非发酵菌与发酵菌以及测定非发酵菌是否利用糖的基本试验。

麦康凯琼脂上：假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等生长，而莫拉菌属和艾肯菌属等不生长。

假单胞菌属铜绿假单胞菌——生物学特性形态与结构形态：细长杆菌。

染色：G-。

特殊结构：无芽胞，无荚膜。

有1～3根鞭毛，运动活泼。

培养特性营养要求：不高。

气体环境：专性需氧。

温度环境：最适35℃，4℃不生长。

菌落特点：普通琼脂平板：圆形大小不一，边缘不整齐、扁平、隆起、光滑湿润且常呈融合状态的菌落。

血液琼脂平板：扁平、湿润、有特殊气味的灰绿色或蓝绿色菌落，有金属光泽；周围有透明溶血环。

选择培养基：（麦康凯琼脂培养基）微小无光泽半透明菌落，48h菌落中心常呈棕绿色。

（SS琼脂培养基）类似沙门菌的菌落，稍久菌落可呈棕绿色。

产生的主要色素：①绿脓素，为蓝绿色，无荧光性；②绿色荧光素。

铜绿假单胞菌——微生物检验及鉴定标本采集：根据病情采集相应的临床标本。

形态学检查分离培养：依据菌落特征、色素（约10%菌株不产生色素）、气味等以及涂片染色结果。

生化试验（鉴定）耐药性具有多重耐药。

初代敏感的菌株在治疗3～4d后可能发生耐药。

亚胺培南耐药主要原因之一是产生金属酶。

铜绿假单胞菌——致病性及临床意义俗称绿脓杆菌。

是医院感染的主要病原体之一。

引起的局部感染常见于烧伤或创伤后，亦可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，甚至引起心内膜炎、肺炎，严重者可引起败血症，死亡率甚高。

假单胞菌属嗜麦芽窄食单胞菌革兰阴性杆菌。

端鞭毛1～8根，有动力、无芽胞、无荚膜。

非发酵G-杆菌(nonfermentative G- Bacilli)1. 非发酵菌是一群需氧、无芽孢、不利用糖或仅能氧化分解糖类是做为能量来源的G-杆菌。

（1）通常所讲的非发酵菌指在KIA中24小时内表面能够生长，在底部不生长的需氧G-杆菌。

（2）非发酵菌与其它苛养或非糖发酵的G-杆菌之间的界限只是传统意义上的，并不是根据明确的遗传或表型特点来划分。

（3）多为条件致病菌，近年来日益增多，尤其是医院感染。

2. 分类与命名：主要的非发酵G-杆菌属被分成6个科：（1）假单胞菌科：根据rRNA-DNA同源性分为5个rRNA群①rRNAⅠ群/假单胞菌属；②rRNAⅡ群/伯克霍尔德菌属；③rRNAⅢ群/丛毛单胞菌属、食酸菌属；④rRNAⅣ群/短波毛单胞菌属；⑤rRNAⅤ群/窄食单胞菌属；⑥其它：鞘氨醇单胞菌属、希瓦菌属等（2）产碱杆菌科：产碱杆菌属；（3）黄杆菌科：华丽杆菌属（4）莫拉菌科：不动杆菌属、莫拉菌属；（5）甲基球菌科；（6）根瘤菌科3. 非发酵菌的基本鉴定要求（1）缺少糖发酵的证据，通常是在KIA或TSI培养基中无酸产生，斜面和底部均呈红色。

（2）氧化酶+（不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、唐菖蒲伯克菌、浅黄华丽单胞菌、栖稻黄素单胞菌-），但并非所有氧化酶+的G-杆菌都是非发酵菌。

（3）麦康凯上生长很差或不生长。

（4）动力：多为+，但多为专性需氧，故半固体培养基中不明显，宜用直接动力观察或染色法。

4. 重要的鉴定试验（1）葡萄糖利用（O/F试验）：O/F培养基:蛋白胨和糖类的比例为1:5而不同于发酵菌的1:2。

（2）氧化酶试验：（3）动力：半固体培养基:应只穿刺培养基顶部4mm，在培养4-6小时后首次观察结果,24和48小时后再次观察结果。

更准确的方法是湿片法和鞭毛染色。

（4）色素形成：非发酵菌可形成多种色素，有助于菌种的鉴定。

（5）硝酸盐还原/产气：将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而释放氮的生化过程。

（6）吲哚试验：需用含色氨酸丰富的培养基，产吲哚黄杆菌、脑膜败血黄杆菌、食酸丛毛单胞菌等+。

非发酵菌的鉴定定义：非发酵菌（nonfermenters）指一群需氧或兼性厌氧、不发酵糖类，能在普通培养基上生长的革兰阴性杆菌。

主要存在外界环境中，种类繁多，多为条件致病菌或医院内感染菌。

关于临床标本中NFB的意义，在混合培养物中见到时，必须考虑到患者的情况和标本来源。

一般来说，以纯培养方式分离自正常无菌部位的NFB，一定要鉴定到种并进行抗生素敏感性试验。

目前CLSI中，K-B法除了假单胞菌属、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌有抗生素敏感性实验的判断标准外，其他非发酵菌没有K-B法的标准。

一、鉴定原则：1．血、无菌部位（脑脊液、胸水等），特殊病人，少见菌可用API-20NE或VIKET TWO-GN 卡鉴定。

2．其它部位如呼吸道标本、临床常见的非发酵，根据菌落形态、生化反应、抗生素耐药谱等综合分析手工法鉴定即可。

二、非发酵性菌基本分类：假单胞菌属Pseudomonas spp.（20多个临床上重要菌种中，铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌等最常见。

）不动杆菌属Acinetoacter spp.（最常分离的种鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌、溶血不动杆菌等）窄食单胞菌Stenotrophomonas spp.（嗜麦芽窄食单胞菌、非洲嗜麦芽窄食单胞菌）伯克霍尔德菌Burkholderia spp.（洋葱伯克霍尔德菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等）鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas spp.（少动鞘氨醇杆菌）无色杆菌属Achromobacter spp.（木糖氧化无色杆菌）希瓦氏菌属Shewanella spp. （腐败希瓦氏菌海藻希瓦氏菌）产硷菌属Alcaligenes spp.黄杆菌属Flavoacterium spp.莫拉菌属Moraxella spp.罗尔斯通菌属 Ralstonia spp.食酸菌属Acidovorax spp.丛毛单胞菌属Comamonas spp.甲基杆菌属Methylobacterium spp.等还有一些未定名的菌群三、辨认非发酵菌的基本要点1. 分离培养基上的菌落有以下情况初步考虑非发酵菌的存在a.培养基上生长较差或中国蓝上不生长的阴性菌。

非发酵菌是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、条件致病菌。

【氧化酶试验】铜绿、粪产碱为阳性，醋酸钙不动杆菌为阴性【非发酵菌生化编码管鉴定】原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参照下述方法，将试验结果换算成4位数字, 加以数值化后查表。

例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734，查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中要求做硝酸盐产气补充实验区分。

无芽胞的革兰阴性杆菌；多为- 4组0-F厌顿2分需氧1分结果：需氧得分匸12组氧化輕分枸携酸2分麦芽犍1分+ + +73纠精氨就4分甘露醇2分木糖1分-+ +4组硝还4分DNA酶2分乙酰胺4分观察结果时按表中说明进行。

—、O-F试验接种2支编码管，1支加无菌石蜡油，另1支不加。

原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。

发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。

本试验又称氧化发酵（0/F或Hugh —Leifson , HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。

二、硝酸盐还原试验原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐和氮气等。

硝还试验是测定还原过程中生成的亚硝酸盐。

如培养基中有亚硝酸盐存在，则亚硝酸盐与醋酸生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，后者与a -萘胺结合成N- a -萘胺偶氮苯磺酸。

假单胞菌等能使硝酸或亚硝酸盐还原为氮气，此为脱硝化或脱氮化作用。

结果解释：/变红一®性沿试验管加AB液各少许变一加锌粉-不变r阳性，产气\变红阴性注意事项：若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否已被还原，可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在；若不出现红色，表示硝酸盐已衩还原为氨和氮。

每日一菌之非发酵菌及检验一、概述非发酵菌主要是指一群①不发酵或不分解糖类的②革兰阴性③无芽胞④需氧杆菌。

目前，非发酵菌包括13个属。

主要有假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。

这些细菌大多为条件致病菌。

对于非发酵菌的鉴定，必须首先进行种属间的鉴别，然后进行种间的鉴定。

一般实验室只需用几项试验，如氧化酶、O-F试验、动力及鞭毛、菌落色素、硝酸盐还原试验以及在麦康凯琼脂上的生长情况等即可对90%～95%分离的菌株作出初步鉴定。

1.培养温度：多数非发酵菌适宜生存于自然界，培养温度以30℃为宜。

有的更适宜生长于室温（18℃～22℃）。

故常规标本应先培养于35℃～37℃，再培养于30℃或室温。

2.动力与鞭毛：在非发酵菌的鉴定中，细菌是否具有鞭毛及鞭毛的特点有重要的诊断意义。

由于非发酵菌大部分为专性需氧菌，在半固体培养基上观察动力不明显，因细菌在琼脂表面生长，底层穿刺生长不良或不生长，故观察非发酵菌的动力以30℃或室温12～24h培养物悬滴法为准。

有时需借助鞭毛染色予以鉴定。

3.氧化酶试验：该试验是鉴定非发酵菌的重要试验，非发酵菌中除不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及个别假单胞菌外，氧化酶试验均为阳性。

4.氧化-发酵（O-F）试验：本试验是确定非发酵菌与发酵菌以及测定非发酵菌是否利用糖的基本试验。

非发酵菌对葡萄糖的代谢特点是氧化型产生微量酸。

在氧化-发酵（O-F）试验中，应为开管产酸，闭管不变。

5.在麦康凯琼脂上生长情况：如假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等生长，而莫拉菌属和艾肯菌属等不生长。

非发酵菌几种主要菌属的基本特征见表5-25-1。

表5-25-1 非发醇菌主要菌属的基本特征二、假单胞菌属假单胞菌属为一大组革兰阴性杆菌，大量存在于水、土壤和空气中。

在人类感染的非发酵菌中，假单胞菌属约占70%～80%，主要为铜绿假单胞菌（约55%～65%）。

其次为嗜麦芽窄食单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、产碱假单胞菌等。