实验：非发酵菌的鉴定

一、实验目的1. 掌握非发酵菌的基本概念及分类；2. 熟悉非发酵菌的鉴定方法；3. 提高实验室操作技能，培养科学思维和严谨的工作态度。

二、实验原理非发酵菌是一类不发酵或不分解糖类的革兰氏阴性杆菌，主要包括假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。

非发酵菌的鉴定主要通过观察菌落特征、进行生化试验、动力与鞭毛观察等手段。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）非发酵菌菌种：假单胞菌、不动杆菌、产碱杆菌、莫拉菌、黄杆菌等；（2）培养基：普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、动力半固体培养基、氧化酶试验培养基等；（3）试剂：葡萄糖、乳糖、酵母提取物、酚红指示剂、氧化酶试剂等；（4）实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、无菌操作台等。

2. 实验仪器：（1）显微镜：用于观察菌落特征；（2）恒温培养箱：用于培养菌种；（3）酒精灯：用于无菌操作；（4）无菌操作台：用于无菌操作。

四、实验方法与步骤1. 菌落观察（1）将菌种接种于普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，分别于30℃、37℃培养24小时；（2）观察菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘、表面、透明度等；（3）记录观察结果。

2. 动力与鞭毛观察（1）将菌种接种于动力半固体培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种在半固体培养基中的生长情况，如是否有鞭毛、菌落是否呈指状、螺旋状等；（3）记录观察结果。

3. 氧化酶试验（1）将菌种接种于氧化酶试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生氧化酶，即菌落周围是否出现绿色；（3）记录观察结果。

4. 氧化-发酵（O/F）试验（1）将菌种接种于氧化-发酵试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生酸，即菌落周围是否出现红色；（3）记录观察结果。

5. 麦康凯琼脂平板生长情况（1）将菌种接种于麦康凯琼脂平板，30℃培养24小时；（2）观察菌种在麦康凯琼脂平板上的生长情况，如是否生长、生长速度等；（3）记录观察结果。

1、贝多芬的童年尽管如是悲惨，他对这个时代和消磨这时代的地方，永远保持着一种温柔而凄凉的回忆。

2、社会永远处在这两条路的中间：真理或爱。

它通常的解决，往往是把真理和爱两者一齐牺牲了。

3、脸上的肌肉突然隆起，血管膨胀、犷野的眼睛变得倍加可怕；嘴巴发抖；仿佛一个魔术家召来了妖魔而反被妖魔制服一般。

4、我的信仰使人厌恶或阻碍别人，这是可能的。

但要更改它却不在我能力范围以内，好似我不能改变我的**一样。

我除了我所相信的以外不能相信别的，尤其在这个我将回到神那边去的时候。

5、也许是他作品中最深刻的，仿佛用血泪写成的，结果是一文都不曾拿到。

把贝多芬煎熬完的是，日常的窘况，无穷尽的讼案：或是要人家履行津贴的诺言，或是为争取侄儿的监护权，因为他的兄弟卡尔于一八一五年死于肺病，遗下一个儿子。

6、我称为英雄的，并非以思想强力称雄的人，而只是靠心灵而伟大的人。

7、没有伟大的人格，就没有伟大的人，甚至也没有伟大的艺术家，伟大的行动者；所有的只是些空虚的偶像，匹配下贱的群众的；时间会把他们一齐摧毁。

成败又有什么相干？主要是成为伟大，而非显得伟大。

8、宽大的鼻子又短又方，竟是狮子的相貌。

一张细腻的嘴巴，但下唇常有比上唇前突的倾向。

牙床结实得厉害，似乎可以磕破核桃。

左边的下巴有一个深陷的小窝，使他的脸显得古怪地不对称。

9、艺术家对于他的作品的爱是艺术的心灵。

没有爱便没有艺术作品。

10、在这些**的痛苦之上，再加另外一种痛苦。

韦格勒说他从没见过贝多芬不抱着一股剧烈的热情。

这些爱情似乎永远是非常纯洁的。

11、他甚至在一八二六年时在自己头上打了一枪。

然而他并不死，倒是贝多芬几乎因之送命：他为这件事情所受的难堪，永远无法摆脱。

12、贝多芬的心灵里多少有些清教徒气息；粗野的谈吐与思想，他是厌恶的：他对于爱情的神圣抱着毫无假借的观念。

13、竭力为善，爱自由甚于一切，即使为了王座，也永勿欺妄真理。

14、有时候，人生的现象与痛苦是那么悲惨，对于我们的爱是一种打击，那时，为了拯救这爱，拯救这信念，我们不得不把它超临人世之上，以致它有和人世脱离一切关系的危险。

一、精氨酸鸟氨酸赖氨酸（1）氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使培养基中的溴甲酚紫指示剂变紫色。

加石蜡油是为了造成一个厌氧环境．因为只有在厌氧环境下生成的胺才稳定．（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基（对照培养基不加氨基酸）。

（3）方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油（氨基酸类反应要与空气隔绝），于35℃培养1～4d，每日观察结果（4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。

阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。

对照管应为黄色。

若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。

（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。

志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。

L－氨基酸按0.5%加入，DL－氨基酸按1%加入。

再行校正pH至6.8。

对照培养基不加氨基酸。

分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。

试验方法：从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养18～24h，观察结果。

氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。

二、枸橼酸盐利用试验(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。

(2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。

(3)结果：若用溴麝香草酚兰（ph6.0以下黄色，ph7.6以上蓝色）指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。

非发酵菌的鉴定定义：非发酵菌（nonfermenters）指一群需氧或兼性厌氧、不发酵糖类，能在普通培养基上生长的革兰阴性杆菌。

主要存在外界环境中，种类繁多，多为条件致病菌或医院内感染菌。

关于临床标本中NFB的意义，在混合培养物中见到时，必须考虑到患者的情况和标本来源。

一般来说，以纯培养方式分离自正常无菌部位的NFB，一定要鉴定到种并进行抗生素敏感性试验。

目前CLSI中，K-B法除了假单胞菌属、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌有抗生素敏感性实验的判断标准外，其他非发酵菌没有K-B法的标准。

一、鉴定原则：1．血、无菌部位（脑脊液、胸水等），特殊病人，少见菌可用API-20NE或VIKET TWO-GN 卡鉴定。

2．其它部位如呼吸道标本、临床常见的非发酵，根据菌落形态、生化反应、抗生素耐药谱等综合分析手工法鉴定即可。

二、非发酵性菌基本分类：假单胞菌属Pseudomonas spp.（20多个临床上重要菌种中，铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌等最常见。

）不动杆菌属Acinetoacter spp.（最常分离的种鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌、溶血不动杆菌等）窄食单胞菌Stenotrophomonas spp.（嗜麦芽窄食单胞菌、非洲嗜麦芽窄食单胞菌）伯克霍尔德菌Burkholderia spp.（洋葱伯克霍尔德菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等）鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas spp.（少动鞘氨醇杆菌）无色杆菌属Achromobacter spp.（木糖氧化无色杆菌）希瓦氏菌属Shewanella spp. （腐败希瓦氏菌海藻希瓦氏菌）产硷菌属Alcaligenes spp.黄杆菌属Flavoacterium spp.莫拉菌属Moraxella spp.罗尔斯通菌属 Ralstonia spp.食酸菌属Acidovorax spp.丛毛单胞菌属Comamonas spp.甲基杆菌属Methylobacterium spp.等还有一些未定名的菌群三、辨认非发酵菌的基本要点1. 分离培养基上的菌落有以下情况初步考虑非发酵菌的存在a.培养基上生长较差或中国蓝上不生长的阴性菌。

每日一菌之非发酵菌及检验一、概述非发酵菌主要是指一群①不发酵或不分解糖类的②革兰阴性③无芽胞④需氧杆菌。

目前，非发酵菌包括13个属。

主要有假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。

这些细菌大多为条件致病菌。

对于非发酵菌的鉴定，必须首先进行种属间的鉴别，然后进行种间的鉴定。

一般实验室只需用几项试验，如氧化酶、O-F试验、动力及鞭毛、菌落色素、硝酸盐还原试验以及在麦康凯琼脂上的生长情况等即可对90%～95%分离的菌株作出初步鉴定。

1.培养温度：多数非发酵菌适宜生存于自然界，培养温度以30℃为宜。

有的更适宜生长于室温（18℃～22℃）。

故常规标本应先培养于35℃～37℃，再培养于30℃或室温。

2.动力与鞭毛：在非发酵菌的鉴定中，细菌是否具有鞭毛及鞭毛的特点有重要的诊断意义。

由于非发酵菌大部分为专性需氧菌，在半固体培养基上观察动力不明显，因细菌在琼脂表面生长，底层穿刺生长不良或不生长，故观察非发酵菌的动力以30℃或室温12～24h培养物悬滴法为准。

有时需借助鞭毛染色予以鉴定。

3.氧化酶试验：该试验是鉴定非发酵菌的重要试验，非发酵菌中除不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及个别假单胞菌外，氧化酶试验均为阳性。

4.氧化-发酵（O-F）试验：本试验是确定非发酵菌与发酵菌以及测定非发酵菌是否利用糖的基本试验。

非发酵菌对葡萄糖的代谢特点是氧化型产生微量酸。

在氧化-发酵（O-F）试验中，应为开管产酸，闭管不变。

5.在麦康凯琼脂上生长情况：如假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等生长，而莫拉菌属和艾肯菌属等不生长。

非发酵菌几种主要菌属的基本特征见表5-25-1。

表5-25-1 非发醇菌主要菌属的基本特征二、假单胞菌属假单胞菌属为一大组革兰阴性杆菌，大量存在于水、土壤和空气中。

在人类感染的非发酵菌中，假单胞菌属约占70%～80%，主要为铜绿假单胞菌（约55%～65%）。

其次为嗜麦芽窄食单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、产碱假单胞菌等。

非发酵菌是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、条件致病菌。

【氧化酶试验】铜绿、粪产碱为阳性，醋酸钙不动杆菌为阴性【非发酵菌生化编码管鉴定】原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参照下述方法，将试验结果换算成4位数字, 加以数值化后查表。

例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734，查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中要求做硝酸盐产气补充实验区分。

无芽胞的革兰阴性杆菌；多为- 4组0-F厌顿2分需氧1分结果：需氧得分匸12组氧化輕分枸携酸2分麦芽犍1分+ + +73纠精氨就4分甘露醇2分木糖1分-+ +4组硝还4分DNA酶2分乙酰胺4分观察结果时按表中说明进行。

—、O-F试验接种2支编码管，1支加无菌石蜡油，另1支不加。

原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。

发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。

本试验又称氧化发酵（0/F或Hugh —Leifson , HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。

二、硝酸盐还原试验原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐和氮气等。

硝还试验是测定还原过程中生成的亚硝酸盐。

如培养基中有亚硝酸盐存在，则亚硝酸盐与醋酸生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，后者与a -萘胺结合成N- a -萘胺偶氮苯磺酸。

假单胞菌等能使硝酸或亚硝酸盐还原为氮气，此为脱硝化或脱氮化作用。

结果解释：/变红一®性沿试验管加AB液各少许变一加锌粉-不变r阳性，产气\变红阴性注意事项：若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否已被还原，可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在；若不出现红色，表示硝酸盐已衩还原为氨和氮。