最新嗜酸乳杆菌增菌培养基设计与生长动力学研究

课程设计说明书课程名称：新编生物工艺学设计题目: 培养基优化设计院系：生物与食品工程学院学生姓名：学号：2专业班级：08生物技术指导教师：关现军2011 年6月3 日课程设计任务书目录1.摘要················································页码2.关键字··············································页码3.设计背景············································页码3.1培养基简介···········································页码3.2培养基优化设计的重用意义····························页码4 设计方案·················································页码 4.1原材料制备···········································页码 4.2菌种的选择···········································页码 4.3营养因子的比例设·····································页码4.4理化条件控制············································页码4.5总工艺流程列叙········································页码5 预期结果················································页码6 方案实施时可能出现的问题与对策·······························页码7 设计感受·················································页码7.1 关于本方案···················································页码 7.2 关于自我·····················································页码8参考文献··················································页码.1 摘要以改良ＭＲＳ发酵培养基为墓础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、际蛋白陈等７个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化。

高效表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株的构建朱丽芳;龙北国;罗军;姜容;范宏英【摘要】目的构建高效表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株.方法从幽门螺杆菌标准株NCTC11639中扩增出幽门螺杆菌黏附素基因Hp0410,克隆入穿梭质粒pMG36e中,通过电穿孔将重组质粒转入嗜酸乳杆菌,表达的目的蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与硝酸银染色及Western blotting鉴定,并检测重组质粒的稳定性.结果扩增的黏附素Hp0410基因与基因库公布的一致,构建的重组质粒成功转入嗜酸乳杆菌中,表达出分子量约34 kD的目的蛋白,Western blotting证实该蛋白可被幽门螺杆菌感染患者血清所识别.重组质粒pMG36e-Hp0410在含有红霉素和不含有红霉素的环境下均稳定.结论成功构建了高效组成型表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的重组嗜酸乳杆菌菌株.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2010(030)002【总页数】4页(P334-337)【关键词】幽门螺杆菌;黏附素Hp0410;嗜酸乳杆菌;活载体疫苗【作者】朱丽芳;龙北国;罗军;姜容;范宏英【作者单位】南方医科大学公共卫生与热带医学学院,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,广东,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R378.2幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是引起慢性胃炎和消化性溃疡的重要病原体，与胃黏膜组织淋巴瘤和胃癌的发生密切相关，人口感染率高达50%以上。

目前根除Hp感染主要采用以抗生素为基础的三联或四联疗法，但易出现复发和耐药性问题等，因此疫苗是控制Hp感染最有效的途径。

浅谈嗜酸乳杆菌及其应用周杨（四川农业大学食品质量与安全2007级02班）摘要：嗜酸乳杆菌是最重要的益生菌之一，广泛分布在人和动物的消化道、阴道以及乳制品和发酵的动植物制品中,是人体肠道中的重要微生物。

本文将从嗜酸乳杆菌的研究历史、形态学特征、生理生化特征、生态特征、培养分离鉴定方法、对人体的健康作用及在医学和食品方面的应用等作简要综述。

关键词：嗜酸乳杆菌; 特征; 作用; 应用A rief discussion on Lactobacillus acidophilus and its applicationsZHOU Y ang(Sichuan Agricultural University, Food Quality and Safety speciality,Grade2007 classe two) Abstract:As one of the most important probiotics, Lactobacillus acidophilus, widely distributed in human and animal digestive tract, vagina, as well as dairy products and fermented products in plants and animals, is an important human gut microbes. This paper will have a brief overview about the investigative history of Lactobacillus acidophilus, morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics, ecological characteristics, culture isolation and identification methods, health effects on the human body , as well as the application in medicine and food ,etc.Key words: Lactobacillus acidophilus; characteristic; function;applications 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)属于乳杆菌属，为革兰阳性无芽胞杆菌。

第45卷第9期包装工程2024年5月PACKAGING ENGINEERING·17·基于嗜酸乳杆菌的时间温度指示器的制备及其性能表征衣然1，马浩洋1，金露达1，张悦1，王洪江1*，李娟1，张东杰1,2（1.黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆163319）摘要：目的为了监测食品贮藏和运输期间的品质，制备微生物时间-温度指示器（TTI）。

方法选择嗜酸乳杆菌作为时间-温度指示器的微生物，对配制成的9种混合pH指示剂溶液进行筛选，用合适的混合pH指示剂溶液制备TTI，加入不同浓度的嗜酸乳杆菌，在不同等温条件下（5、15、25 ℃）贮藏检测其指标，以合适的指标参数为响应值探究其动力学与温度依赖性。

结果9种混合pH指示剂溶液中有5种颜色变化较明显，用其中一种制备TTI，以色差值（∆E）为响应参数得出其活化能（E a）为84.9 kJ/mol。

结论5种颜色变化较明显的混合pH指示剂溶液可以作为TTI的指示剂，制备的微生物型TTI有潜力应用于活化能59.9 kJ/mol≤E a≤109.9 kJ/mol的食品品质指标的货架期预测中。

关键词：微生物时间-温度指示器（TTI）；嗜酸乳杆菌；pH指示剂；温度依赖性中图分类号：TS206.6 文献标志码：A 文章编号：1001-3563(2024)09-0017-08DOI：10.19554/ki.1001-3563.2024.09.003Preparation and Characterization of Time and Temperature Indicator Based onLactobacillus AcidophilusYI Ran1, MA Haoyang1, JIN Luda1, ZHANG Yue1, WANG Hongjiang1*,LI Juan1, ZHANG Dongjie1,2(1. Heilongjiang Bayi Agricultural University, Heilongjiang Daqing 163319, China;2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Heilongjiang Daqing 163319, China)ABSTRACT: The work aims to prepare microbial time-temperature indicators (TTIs) for monitoring the quality of food products during storage and transportation. Lactobacillus acidophilus was selected as the microorganism of the time-temperature indicator, and nine mixed pH indicator solutions were prepared for screening. The TTI was prepared with suitable mixed pH indicator solutions, and the indicators were evaluated by adding different concentrations of Lactobacillus acidophilus and stored under different isothermal conditions (5, 15 and 25 ℃), and the kinetics and temperature dependence were investigated with suitable indicator parameters as response values. Five of the nine mixed pH indicator solutions had significant color changes, one of which was used to prepare the TTI, and the activation energy (E a) was 84.9 kJ/mol with the total color difference value (∆E) as the response parameter. Five mixed pH indicator solutions with significant color changes can be used as indicators for the TTI, and the prepared microbial-type TTI has potential to be applied in shelf life prediction of food with an activation energy of quality index from 59.9 kJ/mol to 109.9 kJ/mol.KEY WORDS: microbial time-temperature indicators (TTIs); lactobacillus acidophilus; pH indicator; temperature dependence收稿日期：2023-08-04基金项目：国家重点研发计划（2018YFE0206300）；黑龙江八一农垦大学博士科研启动项目（XDB-2017-14）；大学生创新创业训练项目（S202210223041）*通信作者·18·包装工程2024年5月随着全球供应链的不断扩大和各行各业的发展，消费者对食品质量和安全的要求不断提高。

嗜酸乳杆菌的培养条件及其生物学特性
张帆;王建华;刘立恒;杨雅麟;滕达
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2005(031)003
【摘要】对嗜酸乳杆菌的培养条件及其生物量、产酸、耐酸、抗胆盐、世代繁殖和抑菌特性的影响做了初步研究.结果表明,最适生长温度为36～38℃,最适起始pH 为5.5～6.2,静置培养比振荡培养好,最高生物量和滴定酸度分别可达1010CFU/mL 和219°T.同时嗜酸乳杆菌具有强耐酸性和耐胆盐性,对大肠杆菌和沙门氏菌有很强的抑菌作用.
【总页数】4页(P43-46)
【作者】张帆;王建华;刘立恒;杨雅麟;滕达
【作者单位】中国农业科学院饲料研究所,国家饲料工程技术研究中心,北
京,100081;中国农业科学院饲料研究所,国家饲料工程技术研究中心,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,国家饲料工程技术研究中心,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,国家饲料工程技术研究中心,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,国家饲料工程技术研究中心,北京,100081
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.54
【相关文献】
1.嗜酸乳杆菌与传统混合菌混合培养条件的优化 [J], 张树海;吴子健;帖航;蔡平平
2.产酶培养条件对一株嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶活力的影响 [J], 王月囡;曹健;张琳;王红军;王育军;于海东
3.嗜酸乳杆菌产细菌素培养基及培养条件的优化 [J], 陈静;何连芳;张玉苍
4.嗜酸乳杆菌产细菌素培养条件的优化 [J], 郝建云;陶冶;刘诗文;肖珊;王晗;王际辉
5.嗜酸乳杆菌培养条件的优化及菌株鉴定 [J], 牛生洋;李刚;赵瑞香;李岩
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乳酸菌生长最佳培养基的筛选Prepared on 22 November 2020乳酸菌生长最佳培养基的筛选摘要：文中通过检测乳酸菌在不同固体和半固体培养基中的菌落数、菌落大小及溶钙圈大小,以筛选出乳酸菌生长的最佳培养基。

实验表明,在添加胡萝卜汁的乳酸菌分离固体培养基上,乳酸菌生长最好,活菌数含量最高,菌落和溶钙圈最大。

同种培养基,半固体培养较固体培养更适于乳酸菌生长,前者出菌快,活菌数多。

关键词：乳酸菌固体培养基半固体培养基菌落乳酸菌是有益于人体健康的益生菌,主要存在于人体肠道,其有助于宿主调整正常菌群,维持肠道微生态环境的平衡。

乳酸菌的代谢产物能降低肠道内的pH值,抑制肠道中腐败菌的生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用,并有帮助消化、防止便秘,防止细胞老化,降低胆固醇,抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用[1-5]。

在食品向天然型、功能型发展的今天,乳酸菌制品正愈来愈受到人们的重视,通过检测乳酸菌在不同固体和半固体培养基中的菌落数,菌落和溶钙圈的大小,以筛选出乳酸菌生长的最佳培养基,用于乳酸菌制品的研究与开发一、材料及方法111菌种及来源保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus),由西北农业大学微生物室提供。

(以下简称乳酸菌)。

112培养基11211固体培养基的筛选RJP培养基(1号):牛肉膏3g;蛋白胨3g;酵母膏3g;乳糖20g;琼脂15g;蒸馏水1000ml;pH610。

LAB培养基(2号):牛肉膏10g;酵母膏10g;乳糖20g;琼脂15g;吐温80110ml;CaCO310g;KH2PO42g;蒸馏水950ml;pH616。

214号培养基(3号):牛肉膏3g,胰胨10g;NaCl5g;酵母膏6g;葡萄糖2g;半胱氨酸013g;琼脂15g;蒸馏水1000ml;pH714~715乳酸菌分离培养基(4号):牛肉膏1g;蛋白胨1g;酵母膏1g;葡萄糖1g;蕃茄汁20%;吐温800105%;CaCO32g;溴甲酚绿0101%;琼脂115g;蒸馏水100ml;pH615。

蜂蜜酸奶发酵过程中乳酸菌生长动力学的初步研究
李皖光;王新文;马艳;季一顺
【期刊名称】《食品与发酵科技》
【年(卷),期】2018(054)002
【摘要】本文研究了蜂蜜酸奶发酵过程中乳酸菌双菌的生长规律,同时研究了活菌数、pH、乳酸含量和还原糖转化率与时间变化的相关性.研究表明:在乳酸发酵过程中,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长动力学性质满足典型对数生长曲线规律,且证实了两者之间存在共生作用;并建立了发酵过程中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的数学模型,确定了世代时间大约为9.3-29.1min;随着发酵的进行,乳酸含量不断增大,体系的pH逐渐下降,还原糖转化率持续升高,在4h达到最高后下降.
【总页数】4页(P4-7)
【作者】李皖光;王新文;马艳;季一顺
【作者单位】安徽省粮油产品质量监督检测站,安徽合肥230031;安徽省粮油产品质量监督检测站,安徽合肥230031;安徽省粮油产品质量监督检测站,安徽合肥230031;安徽省粮油产品质量监督检测站,安徽合肥230031
【正文语种】中文
【中图分类】TQ930.1
【相关文献】
1.酸奶发酵过程中物理性质和乳酸菌生长规律研究 [J], 林伟锋;刘宏锋;赵谋明;赵强忠
2.西宁传统发酵酸奶中乳酸菌的分离鉴定及发酵特性研究 [J], 姚沛琳;苏博;张新剑;黄悦;姜华
3.酸浆果蜂蜜酸奶发酵及贮藏过程中抗氧化活性的变化研究 [J], 王然;张春玉;贾燕妮
4.芒果酸奶发酵及后熟过程中乳酸菌素的产生及其抑菌作用 [J], 吴小艳;刘文星;刘忠义;李希宇;付满;李汀
5.牛蒡苹果蜂蜜复合酸奶发酵工艺的初步研究 [J], 王晓丽;薛毅;鱼佳新;张馨尹;张晋荣;罗欢;高建华
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乐托尔
（lacteol fort）
本品为灭活的嗜酸乳杆菌菌体及其代谢产物。

【药理及应用】本品所含菌株为自人粪分离得到的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophiliis）。

由于采用真空冷冻干燥法，细菌经过热处理已被灭活，故本品含菌量高且稳定。

体外及动物实验证明，嗜酸乳杆菌代谢过程中产生的乳酸及结构未明的抗生素有直接的抑菌作用。

本品所含维生素B能刺激肠道内正常产酸菌丛的生长。

嗜酸乳杆菌的代谢产物对肠粘膜有非特异性免疫刺激作用，能增强免疫球蛋白的合成。

实验还证明，嗜酸乳杆菌菌株有粘附于培养中人体结肠细胞刷状缘的特性，这一作用可抗拒产毒素和侵入性生物对肠的粘附。

本品主要用于急慢性腹泻的对症治疗。

【用法】胶囊剂，成人及儿童每日2次，每次2粒，成人首剂量加倍；婴儿每日2次，每次1～2粒，首剂量2粒。

散剂，成人及儿童每日2次，每次1袋，成人首剂量加倍；婴儿每日2次，每次1袋。

胶囊剂可用水吞服，亦可倒出内容物混合于水中饮眼。

【注意】本品所含菌株已经灭活，故与抗生素同服时不影响本品疗效。

本品亦不诱导致病菌产生耐药性。

怀孕期间用药无畸形形成影响的报告。

【制剂】胶囊剂：每胶囊含灭活冻干的嗜酸乳杆菌50亿和中和后冻干的培养基80mg；散剂：每小袋含灭活冻干的嗜酸乳杆菌50亿和中和后的冻干培养基160mg。

嗜酸乳杆菌-地衣芽孢杆菌融合子的制备工艺优化高媛惠1,2,马林峰2,霍乃蕊2（1.太原海关技术中心，山西太原030024；2.山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）摘要:研究旨在优化嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的原生质体制备工艺来获得融合子，为产芽孢乳酸菌的育种和改良提供新的思路。

通过单因素试验考察菌龄、溶菌酶浓度、酶解温度和时间对原生质体形成率和再生率的影响，并在此基础上，以原生质体形成率为指标，通过正交试验优化原生质体制备工艺。

结果表明，菌龄和酶解时间对原生质体形成率影响较大，其次为酶解温度和溶菌酶浓度。

嗜酸乳杆菌原生质体制备的最优工艺为取培养12h 的对数生长中后期菌体用5.0mg/mL 溶菌酶37℃酶解30min ；地衣芽孢杆菌则取培养8h （对数生长中后期）的菌体用2.5mg/mL 溶菌酶37℃酶解3h 。

在上述条件下制备亲代细胞的原生质体，以PEG6000促融，嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的原生质体融合率分别为4.6×10-6和3.8×10-6。

原生质体制备工艺的优化是嗜酸乳杆菌-地衣芽孢杆菌融合子制备及获得高融合率的关键，融合子的获得可为筛选既能形成芽孢又可产蛋白酶和淀粉酶的高性能乳酸菌菌株奠定基础。

关键词:嗜酸乳杆菌；地衣芽孢杆菌；原生质体融合；产芽孢乳酸菌中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:1002-2481（2021）02-0121-05Optimization of the Technique for the Preparation of the Fusant ofLactobacillus acidophilus and Bacillus licheniformisGAO Yuanhui 1，2，MA Linfeng 2，HUO Nairui 2（1.Technical Center of Taiyuan Customs of the People's Republic of China ，Taiyuan 030024，China ；2.College of Veterinary Medicine ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：The study aimed to optimize the protoplast preparation technology of Lactobacillus acidophilus and Bacillus licheniformis to obtain the fusants,so as to provide new strategy for breeding and modification of spore-producing lactobacillus.The effects of bacterial culture time,lysozyme concentration,enzymolysis temperature and time on protoplast formation rate and regeneration rate were investigated by single factor test.On this basis,the protoplast formation rate was taken as the index,the protoplast preparation process was optimized by orthogonal test.The results showed that bacterial culture time and enzymolysis time had the greatest influenceon the formation rate of protoplast,followed by enzymolysis temperature and lysozyme concentration.The optimal protoplast preparation process of Lactobacillus acidophilus was as follows ：the medium-late period bacteria,cultured for 12h,was hydrolyzed with 5.0mg/mL lysozyme at 37℃for 30min,and Bacillus licheniformis of the same period cultured for 8h was hydrolyzed with 2.5mg/mL lysozyme at 37℃for 3h.Under the above conditions,protoplasts were prepared and fused with PEG6000.The protoplast fusion rates of Lactobacillus acidophilus and Bacillus licheniformis were 4.6×10-6and 3.8×10-6,respectively.The optimization of the technology of protoplast preparation was critical both for the fusion of Lactobacillus acidophilus and Bacillus licheniformis .The fusants obtained laid a foundation for the screening of spore-producing lactic acid bacteria with the high capacity to produce protease and amylase.Key words ：Lactobacillus acidophilus ;Bacillus licheniformis ;protoplast fusion;spore-producing lactobacillus收稿日期:2020-09-30基金项目:山西省重点研发计划项目（201803D221023-4；201803D221024-2）作者简介:高媛惠（1988-），女，山西太原人，中级工程师，主要从事食品微生物研究工作。

2021年第47卷第1期(总第421期)125㊀DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.024501引用格式:孔庆敏,朱慧越,田培郡,等.嗜酸乳杆菌La28对丙戊酸暴露引起的子代大鼠外周炎症和肝损伤的缓解作用[J].食品与发酵工业,2021,47(1):125-131.KONG Qingmin,ZHU Huiyue,TIAN Peijun,et al.Alleviation effects on peripheral in-flammation and liver damage by Lactobacillus acidophilus La28in offspring rats induced by valproic acid exposure [J].Food and Fermentation Industries,2021,47(1):125-131.嗜酸乳杆菌La28对丙戊酸暴露引起的子代大鼠外周炎症和肝损伤的缓解作用孔庆敏,朱慧越,田培郡,赵建新,张灏,陈卫,王刚∗(江南大学食品学院,江苏无锡,214122)摘㊀要㊀为评价嗜酸乳杆菌La28对丙戊酸(valproic acid ,VPA )暴露引起的子代大鼠外周炎症和肝损伤的作用,同时明确其对VPA 大鼠肠道菌群的调节作用㊂在大鼠孕期12.5d 腹腔注射VPA 和生理盐水,断奶后,随机选取雄性子代分成对照组㊁VPA 组㊁La28组和利培酮(MED )组(n =5),La28组每天灌胃菌液(109CFU /mL ),对照㊁VPA 和MED 组灌胃等量生理盐水和药物,干预期28d ㊂干预结束后,评价外周炎症㊁肝功能和肠道菌群的改善情况㊂与VPA 组大鼠相比,嗜酸乳杆菌La28干预能显著地改善VPA 大鼠的外周炎症和肝功能,其中对IL-6㊁TNF-α㊁ALT 和GGT 的作用效果更为显著㊂此外,嗜酸乳杆菌La28可能通过上调Allobaculumhe 和Mucispirillum 的相对丰度,增加厚壁菌门丰度,降低拟杆菌门丰度从而改善VPA 暴露引起子代大鼠的神经炎症和肝功能㊂关键词㊀嗜酸乳杆菌La28;丙戊酸;外周炎症;肝功能;肠道菌群第一作者:博士研究生(王刚副教授为通讯作者,E-mail:wanggang@)基金项目:国家自然科学基金项目(31972052);中央高校基本科研业务费专项资金项目(JUSRP22006)收稿日期:2020-05-20,改回日期:2020-07-15㊀㊀丙戊酸(valproic acid,VPA)是目前治疗癫痫最常用的药物之一[1],而肝毒性是其应用过程中最严重的并发症之一,一种类型是可逆性肝功能不全,另一种类型的肝损害是不可逆性的肝中毒甚至死亡[2-3],实验表明,孕期服用VPA 的含量与胎儿致畸程度㊁认知及社交障碍正相关,并且对子代的免疫系统和肝脏功能也同样具有一定的影响[4]㊂结合RO-DIER 等[5]在1996年首次通过大鼠子宫暴露VPA 得到子代自闭症(autism spectrum disorder,ASD)大鼠,因其所得ASD 大鼠与临床症状相似,孕期高浓度VPA 干预已成为获取ASD 模型动物的常用造模方法㊂ASD 患者常伴随胃肠道功能紊乱,与ASD 严重程度呈正相关,多表现为肠漏㊁便秘㊁腹泻㊁食道反流㊁腹痛和胀气等症状[6]㊂当肠道微生态系统失衡,肠道黏膜屏障受损时,肠道微生物代谢产物包括内毒素㊁氨㊁吲哚㊁酚类㊁短链脂肪酸㊁假性神经递质前体㊁炎症介质等透过肠道屏障进入肠系膜淋巴组织,过度激活机体免疫系统,引起异常免疫反应,导致肝细胞凋亡㊁坏死㊂此外,来自肠道中的各种毒素需要由肝脏清除,同时肝脏还能清除肠源性细菌㊁真菌等,更加重了肝功能受损[7]㊂已有研究表明益生菌可以通过对肠道微生态系统的维护,降低内毒素和血氨等浓度,缓解肝脏的损伤,改善肝脏代谢功能[8]㊂本研究通过孕期高浓度VPA 暴露获得ASD 大鼠,考察从断乳后到性成熟嗜酸乳杆菌La28干预对孕期VPA 暴露引起的子代大鼠外周炎症和肝功能的作用,为筛选出更适合ASD 患儿发育过程的益生菌提供参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀实验材料1.1.1㊀实验菌种及培养基嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus )La28来自于菌种保藏中心,菌株分离自健康人肠道㊂Wistar 大鼠(雄性5只,初始体质量280~290g;雌性10只,初始体质量220~250g),北京维通利华实验动物技术有限公司㊂本研究经江南大学实验动物伦理委员会批准(JN.NO.20180915S0601230[183]),并按照欧洲共同体关于实验动物的准则(Directive 982010/63/EU)进行操作㊂培养基:MRS 培养基+0.05%L -半胱氨酸盐酸盐㊂126㊀2021Vol.47No.1(Total 421)1.1.2㊀主要试剂IFN-γ㊁TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6和IL-10Elisa 试剂盒,R&D Systems 公司;利培酮,西安杨森制药有限公司;粪便提取试剂盒(FastDNA Spin Kit for Feces),MP Biomedicals,Santa Ana,CA;L -半胱氨酸盐酸盐,国药集团化学试剂有限公司㊂1.1.3㊀主要仪器与设备BS-480全自动生化分析仪,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;AW500SG 大型厌氧工作站,英国Electrotek 有限公司;SW-CJ-1CV 型微生物操作超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;大容量冷冻离心机,美国Beckman 公司;高速冷冻离心机,Eppen-dorf 公司;UV-1800紫外可见分光光度合计,岛津仪器有限公司;高温高压灭菌锅,日本SANYO 公司㊂1.2㊀灌胃用菌制备将冻存在保护剂内的嗜酸乳杆菌La28于液体培养基活化3次,活化后的菌液按体积分数为2%接种到液体培养基中,37ħ条件下厌氧培养18h,8000ˑg 离心20min,以无菌生理盐水清洗菌体2遍后,用10%脱脂乳作为保护剂(采用倾注法测得菌落总数为109CFU /mL),冻存在-80ħ备用,灌胃前,6000ˑg 离心3min,用生理盐水重悬㊂1.3㊀动物实验大鼠饲养于江南大学实验动物中心,室温(25ʃ2)ħ,相对湿度50%~55%,光照时间12h,黑暗时间12h㊂适应1周后,于下午17ʒ00合笼,雌雄数量比例2ʒ1㊂第2天早上8ʒ00前对每只雌鼠进行阴道涂片检查,观察到精子则记录为妊娠第0.5天,雌鼠受孕后分笼饲养,分为实验组(n =5)和对照组(n =5)㊂孕期12.5d,孕鼠腹腔注射600mg /kg 的VPA (用生理盐水配制丙戊酸钠溶液至质量浓度250mg /mL)[9],而在对照组腹腔注射等量的生理盐水㊂实验组出生的雄性大鼠被分配到模型组,而对照组出生的雄性大鼠在出生后第21天被分配到健康组㊂从4周龄到8周龄,每天同一时间,嗜酸乳杆菌La28组(La28,n =5)灌胃菌液,模型组(VPA,n =5)和空白组(对照,n =5)灌胃等量生理盐水,药物对照组(MED,n =5)灌胃等量生理盐水配制的利培酮㊂8周龄的最后一天,乙醚麻醉,取血后处死,凝血后于1500ˑg 离心15min,取血清,冻存在-80ħ备用㊂1.4㊀外周炎症评价采用全自动生化分析仪检测3组血清中IgA㊁IgG㊁IgM 和C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP);用Elisa 试剂盒检测IFN-γ㊁TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6和IL-10㊂1.5㊀肝功能评价采用全自动生化分析仪检测3组血清中的谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)㊁谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)㊁碱性磷酸酶(alka-line phosphatase,ALP )和γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyl transferase,GGT)㊂1.6㊀肠道菌群分析VPA 组大鼠(n =5)㊁对照组大鼠(n =5)㊁MED 组(n =5)和La28组(n =5)大鼠在出生后第56天收集粪便样本,使用粪便DNA 提取试剂盒提取DNA㊂利用Illumina MiSeq 平台对V3~V4区域进行扩增和测序[10]㊂1.7㊀统计与分析实验数据均以平均值ʃ均值标准误差(mean ʃSD)表示㊂每个实验至少重复3次㊂采用One-Way ANOVA 以及Fisher s LSD 检验进行数据统计分析,P <0.05时具有显著性差异㊂采用GraphPad Prism 7和R 作图,在Glaxay 平台进行LEfSe 软件分析,设置LDA Score 的默认筛选值为2㊂2㊀结果与分析2.1㊀孕鼠VPA 暴露对子代的影响孕期暴露的VPA 可通过外周血循环和胎盘屏障均可直接进入子代体内,利用其神经毒性参与子代神经管闭合,从而引发先天性的神经系统发育性疾病,此外,还会引起子代唇裂或腭裂㊁先天性心脏病㊁肢体缺陷㊁泌尿生殖器缺陷及肝脏脂质代谢障碍等疾病[9]㊂如图1所示(对照和VPA 组大鼠均为5日龄),孕期子宫暴露600mg /kg VPA 的子代大鼠出现了全部尾部畸形和部分手部畸形,尾部的畸形多表现为弯曲形状,且与健康组比较短,手部的畸形表现为缺指,表明VPA 在孕鼠子宫中成功暴露[11]㊂此外,SCHNEIDER 等[12]发现孕期VPA 暴露所得的自闭雄性小鼠的行为表现与ASD 患者的临床表现更为相似,因此本文选择雄性子代进一步实验㊂2.2㊀嗜酸乳杆菌La28对孕期VPA 暴露引起的子代大鼠外周炎症的作用2.2.1㊀嗜酸乳杆菌La28对血清细胞因子的作用细胞因子通过促炎和抗炎途径调节免疫反应㊂外周细胞因子可跨越血脑屏障参与中枢神经活动㊂外周和神经炎症在ASD 进程中发挥重要作用,ASD2021年第47卷第1期(总第421期)127㊀图1㊀VPA 暴露对子代大鼠的致畸作用Fig.1㊀The teratogenic effect on offspring rats by VPA exposure患者外周促炎因子水平上调,抑炎因子水平下调,同时伴随着持续的神经炎症[13]㊂由图2可知,从断奶到性成熟期,孕期VPA 暴露的子代大鼠血清中促炎因子IL-1β㊁IL-6㊁IFN-γ和TNF-α水平显著升高,抑炎因子IL-10水平显著下降㊂利培酮可以显著下调大鼠的血清中IL-1β和TNF-α水平,但对IFN-γ水平没有明显的下调作用,甚至MED 组比VPA 组稍高,此外,利培酮可以辅助下调IL-6水平,上调IL-10水平㊂嗜酸乳杆菌La28可显著下调大鼠血清中IL-6和TNF-α水平,同时IFN-γ和IL-1β水平均有所下降,IL-10水平上调,因此,嗜酸乳杆菌La28可以辅助降低促炎因子浓度上调抑炎因子水平,从而调节早期VPA 暴露引起的血清促炎和抑炎因子水平的异常㊂已有研究明确益生菌在免疫调节中的作用,主要通过提高上皮细胞的完整性,调节上皮细胞分泌细胞因子提高免疫应答[14]㊂另外还可以辅助抑制NF-κB 激活[15]和调节Toll 样受体的表达[16],降低促炎细胞因子的表达㊂图2㊀嗜酸乳杆菌La28对血清细胞因子IL-1β㊁IL-6㊁IL-10㊁IFN-γ和TNF-α水平的影响Fig.2㊀Effects of L.acidophilus La28on the level of IL-1β,IL-6,IL-10,IFN-γand TNF-α2.2.2㊀嗜酸乳杆菌La28对血清CRP 的作用CRP 是由肝脏合成的一种五聚体蛋白,是体内急性相反应标志物[17]㊂已有研究表明,外周血CRP 水平升高与抑郁症㊁躁郁症㊁精神分裂症等神经系统类疾病有关[18-19]㊂此外,动物研究已经报道,外周血CRP 水平反映的慢性炎症状态与小鼠的ASD 样行为相关[20-21]㊂且已有报道益生菌可参与下调CRP 水平[22],本研究中孕期VPA 暴露的子代大鼠血清中CRP 水平显著上调(图3)㊂利培酮可下调大鼠的血清CRP 水平,从断奶到性成熟期灌胃嗜酸乳杆菌La28的大鼠血清中CRP 水平下调,虽然MED 组和嗜酸乳杆菌La28组均可下调CRP 水平,但两组与VPA组均没有显著性差异,因此,嗜酸乳杆菌La28可以缓解早期VPA 暴露引起的血清免疫因子CRP 水平异常㊂128㊀2021Vol.47No.1(Total 421)图3㊀嗜酸乳杆菌La28对血清CRP 水平的影响Fig.3㊀Effects of L.acidophilus La28on the level of CRP2.2.3㊀嗜酸乳杆菌La28对血清免疫球蛋白的作用研究发现ASD 患者的IgG 亚型不全,IgA 的血清含量低[23],其中血清型IgA 存在于血清中,血清IgA 具有某些IgG 和IgM 的免疫功能,特异性IgA 能中和血液中的抗原,同时也出现替代性补体免疫系统[24]㊂另外,有研究表明有些ASD 患者的IgA 含量极低,甚至几乎没有,而分泌型IgA 具有保护肠壁的黏膜组织的功能,因而ASD 患者的肠黏膜较容易受损[23],这与本实验结果一致㊂由图4可知,孕期VPA 暴露的子代大鼠血清中IgG 和IgA 水平显著上调,IgM 无显著性差异㊂利培酮可显著下调大鼠的血清IgG 水平,对IgA 和IgM 没有明显调节作用㊂从断奶到性成熟,嗜酸乳杆菌La28的干预可下调大鼠血清中IgG 水平,但与VPA 组没有显著性差异,与MED 组同样对IgA 和IgM 没有明显调节作用㊂嗜酸乳杆菌La28对早期VPA 暴露引起的免疫球蛋白IgG 水平异常有明显作用,且这与已有研究表明益生菌干预机体IgA 的水平没有显著调控效果结果一致[25-26]㊂图4㊀嗜酸乳杆菌La28对血清IgG㊁IgM 和IgA 水平的影响Fig.4㊀Effects of L.acidophilus La28on the level of IgG,IgM and IgA2.3㊀嗜酸乳杆菌La28孕期VPA 暴露的子代大鼠肝功能的作用如图5所示,孕期VPA 暴露的子代大鼠ALT㊁AST㊁ALP 和GGT 水平显著上调㊂利培酮可下调大鼠ALT㊁AST㊁ALT 和GGT 水平,提升肝功能,从断奶到性成熟期,嗜酸乳杆菌La28的干预可下调大鼠ALT ㊁AST ㊁ALP 和GGT 水平,且可显著调节ALT 和GGT 水平㊂因此,嗜酸乳杆菌La28可以显著缓解早期VPA 暴露引起的肝损伤㊂研究表明,益生菌主要通过改善肠道环境,调控肠道微生物组成结构和短链脂肪酸等代谢产物水平来维持肠道屏障功能,加强肠道的黏膜屏障作用,减少肠源性内毒性通过门静脉系统㊁内循环系统进入肝脏,进而改善肝脏病变程度[27-28]㊂图5㊀嗜酸乳杆菌La28对ALP㊁ALT㊁AST 和GGT 水平的影响Fig.5㊀Effects of L.acidophilus La28on the level of ALP,ALT,AST and GGT2.4㊀孕期VPA 暴露的子代大鼠外周炎症和肝功能指标的相关性分析已有研究表明,外周炎症和肝功能密切相关,来自肠道中的各种毒素通过门静脉系统作用于肝脏,引发炎症反应,导致肝功能受损[29-30]㊂因而,对本实验中的外周炎症指标和肝功能指标进行相关性分析(图6),发现IFN-γ㊁TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6㊁CRP 和IgG 与肝功能指标均呈正相关,其中IL-6与ALT(r =0.700,P =0.024)㊁AST(r =0.702,P =0.024)㊁ALP(r =0.723,P =0.018)和GGT (r =0.790,P =0.007)4个指标都显著正相关,IL-1β与ALP (r =0.729,P =0.017)呈显著正相关㊂IL-10与ALT(r =2021年第47卷第1期(总第421期)129㊀-0.773,P =0.009)㊁AST(r =-0.745,P =0.013)和GGT(r =-0.705,P =0.023)4个指标都显著负相关㊂嗜酸乳杆菌La28可以显著降低外周IL-6的水平,同时也显著降低了ALT 和GGT 的表达水平,因而推测嗜酸乳杆菌La28可能是通过调节VPA 大鼠肠道环境降低外周IL-6的水平从而达到改善肝功能效果㊂图6㊀外周炎症与肝功能指标相关性分析Fig.6㊀Correlation analysis between peripheral inflammationand liver function indicators2.5㊀嗜酸乳杆菌La28对孕期VPA 暴露的子代大鼠神经炎症和肝功能的综合作用效果利用主成分分析对上述所有指标进行综合分析,由图7可知,嗜酸乳杆菌La28对VPA 暴露引起的子代大鼠的外周炎症和肝功能的综合缓解能力较好㊂图7㊀外周炎症与肝功能指标综合主成分分析Fig.7㊀Principal component analysis of peripheral inflammationand liver function indicators2.6㊀嗜酸乳杆菌La28对VPA 暴露的子代大鼠肠道菌群的影响越来越多的证据表明肠道菌群失衡与ASD 的严重程度有关[31],基于肠道菌群失调在ASD 中的作用,利用益生菌将肠道菌群重塑为健康状态是近几年提出的作为ASD 的潜在治疗方法㊂因此,基于16S rRNA 扩增测序手段,进一步研究了嗜酸乳杆菌La28对孕期VPA 暴露的子代大鼠的肠道微生物的影响㊂已有发现,在孤独症儿童的粪便样本中,厚壁菌门的丰度低于健康儿童,厚壁菌门与拟杆菌门比值(F /B)升高[32-33]㊂这与本实验研究结果一致,如图8-a 所示,孕期VPA 暴露的子代大鼠F /B 显著上调,嗜酸乳杆菌La28和利培酮干预可以降低F /B水平,表明嗜酸乳杆菌La28菌群组成上能够发挥调节作用㊂利用LEfSe 分析确定了各组的优势菌群(图8-b),在属水平上,孕期VPA 暴露的子代大鼠的优势菌属为Roseburia ;利培酮干预后优势菌属为Pseudomonas 和Bifidobacterium ;嗜酸乳杆菌La28干预后的优势菌属为Anaerostipes ㊂进一步对各组肠道菌群的属水平进行分析,从图8-c 可知,与孕期VPA 暴露的子代大鼠的肠道菌群比,嗜酸乳杆菌La28可以显著提高Mucispirillum ㊁Allobaculumhe ㊁Desulfo-vibrio ㊁Lactobacillus ㊁Odoribacter 和Bifidobacterium 丰度(P <0.05),其中对照组与嗜酸乳杆菌La28组的Allobaculumhe 丰度没有差异,且均高于VPA 组和MED 组,嗜酸乳杆菌La28组的Mucispirillum 显著性高于其他3组㊂说明嗜酸乳杆菌La28通过上调Allobaculumhe 和Mucispirillum 的相对丰度,增加厚壁菌门丰度,降低拟杆菌门丰度来调节肠道菌群从而改善VPA 暴露引起子代大鼠的神经炎症和肝功能㊂3㊀结论经嗜酸乳杆菌La28干预后,对VPA 暴露引起子代大鼠的神经炎症和肝功能具有有效的改善作用㊂其中,嗜酸乳杆菌La28对抑制促炎因子IL-6和TNF-α的表达和调节肝代谢酶ALT 和GGT 的表达效果更佳,且在肠道菌群调节上效果更为显著,为筛选出更适合ASD 患儿发育过程的益生菌提供一定参考㊂参考文献[1]㊀VAJDA F J E,O BRIEN T J,GRAHAM J E,et al.Valproate-asso-ciated foetal malformations-rates of occurrence,risks in attemptedavoidance [J ].Acta Neurologica Scandinavica,2018,139(1):42-48.[2]㊀ABDELKADER N F,ELYAMANY M,GAD A M,et al.Ellagic acidattenuates liver toxicity induced by valproic acid in rats[J].Journalof Pharmacological Sciences,2020,143(1):23-29.[3]㊀BASSETT J T,RODRIGUEZ B,MULLIGAN L,et al.Acute liverfailure in a military recruit treated with valproic acid and harboring a130㊀2021Vol.47No.1(Total 421)a-厚壁菌门与拟杆菌门比值;b-属水平各组优势菌群;c-门水平和属水平丰度差异g-属水平;p-门水平;f-科水平;o-目水平;k-界水平图8㊀嗜酸乳杆菌La28对肠道菌群的影响Fig.8㊀Effects of L.acidophilus La28on gut microbiotapreviously unrecognized polg-1mutation [J ].Epilepsy &behavior reports,2019,12:100342.[4]㊀ZHAO G,GAO J Q,LIANG S,et al.Study of the serum levels of pol-yunsaturated fatty acids and the expression of related liver metabolic enzymes in a rat valproate-induced autism model [J].InternationalJournal of Developmental Neuroscience,2015,44:14-21.[5]㊀RODIER P M,INGRAM J L,TISDALE B,et al.Embryological originfor autism:Developmental anomalies of the cranial nerve motor nu-clei [J ].the Journal of Comparative Neurology,1996,370(2):247-261.[6]㊀HOLINGUE C,NEWILL C,LEE L,et al.Gastrointestinal symptomsin autism spectrum disorder:A review of the literature on ascertain-ment and prevalence[J].Autism Research,2018,11(1):24-36.[7]㊀BRANISTE V,ALASMAKH M,KOWAL C,et al.The gut microbiotainfluences blood-brain barrier permeability in mice [J ].Science Translational Medicine,2014,6(263).DOI:10.1126/scitranslmed.3009759.[8]㊀TRIPATHI A,DEBELIUS J W,BRENNER D A,et al.Publisher cor-rection:The 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Compared with rats in VPA group,L.acidophilus La28significantly improved peripheral inflammation and liver function in rats.The effects on IL-6,TNF-α,alanine aminotransferase(ALT)andγ-glutamyl transpeptidase(GGT)were more significant.In addition,L.ac-idophilus La28might improve the peripheral inflammation and liver function through regulating the relative abundance of Allobaculumhe and Mucispirillum,increasing Firmicutes abundance,and decreasing Bacteroides abundance.Key words㊀Lactobacillus acidophilus La28;valproic acid;peripheral inflammation;liver function;gut microbiota2021年第47卷第1期(总第421期)131㊀。