Bcl-2检测及细胞凋亡通路

东北农业大学

硕士学位论文

环境雌激素对小鼠睾丸支持细胞的影响及分子机制的研究

姓名：刘姗姗

申请学位级别：硕士

专业：发育生物学

指导教师：严云勤

20080620摘要

摘要

环境雌激素（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｅｓｔｒｏｇｅｎｓ），又称环境内分泌干扰物质（ｅｎｄｏｃｄｎｅｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ，ＥＤｓ），是指一类存在环境中能干扰人或动物体内分泌系统并导致异常效应的物质。环境雌激素对人类生存环境的损害正在日益成为人类面临的一个严竣问题。环境雌激素能够影响自然界生物包括人类的健康，导致各种疾病，它的影响是多方面的，其中对雄性生殖系统机能的危害最引人注目。大量动物实验证明，ＥＤｓ能够影响雄性生殖系统的发育和功能，但其作用机制非常复杂，尤其在分子机制方面目前不甚了解，另外环境雌激素存在较多种类，它们之间还具有协同作用，单独检测某～种环境雌激素活性可能会低估其潜在的危害性，这样就更增加了其危害作用及机理的复杂性，因此有必要对一些常见的环境雌激素进行混合性效应研

究。本实验采用组合酶消化、选择性贴壁的方法，分离得到了高纯度的小鼠睾丸支持细胞：

在ＤＭＥＭ培养基中添加不同浓度（１０母，１０。，１０＂５ｔｏｏｌ／Ｌ）的双酚Ａ（ｂｉｓｐｈｅｎｏｌＡ，ＢＰＡ）、大豆异黄酮（Ｓｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ）、ＢＰＡ与大豆异黄酮的共同处理以及这两种环境雌激素分别与睾酮的混合，作用体外培养的小鼠睾丸支持细胞，然后用激光共聚焦显微镜检测细胞色素

Ｃ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ，ｃｙｔＣ）和Ｂｃｌ．２家族蛋白中Ｂａｘ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＢｃｌ－２ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｂｃｌ－２（Ｂ．ｃｅｌｌｌｅｕｌｃｅｍｉａ－ｌｙｍｐｈｏｍａ２）的表达变化。实验结果显示：１．应用组合酶消化、选择性贴壁的方法，分离得到的小鼠睾丸支持细胞的纯度达到９０％

以上。２．激光共聚焦显微镜检测结果显示：低浓度（１０－ｇｍｏｌ／Ｌ，）的ＢＰＡ或大豆异黄酮单独处理组与对照组相比，细胞色素Ｃ的信号较强，Ｂｃｌ－２家族蛋白中Ｂａｘ的信号较弱、Ｂｃｌ－２的信号较强；随着ＢＰＡ或大豆异黄酮处理组剂量的升高（１０－７，１０～ｍｏＰＬ），细胞色素Ｃ的信号逐渐降低，Ｂｃｌ－２家族蛋白中Ｂａｘ的信号逐渐增强、Ｂｃｌ－２的信号逐渐降低，说明低浓度的ＢＰＡ或大豆异黄酮对小鼠睾丸支持细胞可能具有促进增殖的作用，高浓度可能促进细胞凋亡。３．与ＢＰＡ或大豆异黄酮（１０＂９ｍｏｌ／Ｌ）单独处理组相比，ＢＰＡ与大豆异黄酮低浓度共同处理（１０＂９ｍｏｌ／Ｌ）小鼠睾丸支持细胞后，细胞色素Ｃ的信号较弱，Ｂｃｌ．２家族蛋白中Ｂａｘ的

信号较强、Ｂｃｌ－２的信号较弱；而高剂量的共同处理组（０＂ＳｍｏＦＬ）与ＢＰＡ、大豆异黄酮（１０－Ｓｍｏｌ／Ｌ）单独处理组相比，细胞色素Ｃ的信号明显增强，Ｂｃｌ－２家族蛋白中Ｂａｘ的信号强度明显减弱、Ｂｃｌ－２的信号明显增强，说明低剂量的ＢＰＡ与大豆异黄酮混合可能出现毒性

叠加反应，而在高剂量时可能发生拮抗现象。４．ＢＰＡ、大豆异黄酮分别与睾酮共同处理（１０＂５ｔｏｏｌ／Ｌ）与ＢＰＡ、大豆异黄酮（１０４ｔｏｏｌ／Ｌ）单独处理组相比，细胞色素Ｃ的信号明显增强，Ｂｃｌ．２家族蛋白中Ｂａｘ的信号明显减弱、Ｂｃｌ一２的信号明显增强，说明这两种环境雌激素与睾酮出现明显的拮抗现象。以上结果表明：ＢＰＡ或大豆异黄酮单独作用体外培养的小鼠睾丸支持细胞时，其作用机制可能相同；ＢＰＡ与大豆异黄酮共同处理小鼠睾丸支持细胞，在低剂量时可能具有叠加作用，而在高剂量时则具有相互拮抗的效应；ＥＤｓ还可以通过拮抗雄激素发挥作用。这些激素

对睾丸支持细胞的影响可能主要通过线粒体通路来实现，并且Ｂｃｌ．２家族蛋白也参与其中。东北农业大学理学硕士学位论文

关键词：环境雌激素；睾丸支持细胞；细胞色素Ｃ：Ｂｅｌ－２家族蛋白

ＩｌＡｂｓｔｒａｃｔ

Ａｓｔｕｄｙｏｆｅｆｆｅｃｔａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｎｍａｌｅ

ｍＯＵＳｅｓｅｒｔｏｌｌｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄＤｙｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｅｓｔｒｏｇｅｎ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｓｔｒｏｇｅｎ（ａｌｓｏｃａｌｌｅｄｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ，ＥＤｓ）ｒｅｆｅｒｓｔｈｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｗｈｉｃｈｅｘｉｓｔｓｉｎｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｔｈｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｃａｎｄｉｓｔｕｒｂｔｈｅｐｅｒｓｏｎｏｒｔｈｅａｎｉｍａｌｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｙｓｔｅｒｍａｎｄ

ｃａｕｓｅｓｔｈｅｕｎｕｓｕａｌｅｆｆｅｃｔ．Ｄａｍａｇｅｔｏｔｈｅｌｉｖｉｎｇｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓａｒｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ

ｂｅｃｏｍｉｎｇａｓｅｒｉｏｕｓｐｒｏｂｌｅｍｆａｃｉｎｇｈｕｍａｎｉｔｙ．Ｒａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎａｔｕｒｅ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈａｎｄｌｅａｄｔｏｄｉｓｅａｓｅｓ．ＴｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＥＤｓｉｓｖａｒｉｏｕｓ；ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅｈａｒｍｏｆｔｈｅｍａｌｅ

ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｃｏｍｐｌｅｘ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｎｏｔｋｎｏｗｎａｔｐｒｅｓｅｎｔＡｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｓｔｒｏｇｅｎａｌｓｏｈａｓ

ｓｙｎｅｒｇｙ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｄｅｔｅｃｔａｃｅｒｔａｉｎｋｉｎｄｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｓｔｒｏｇｅｎａｃｔｉｖｉｔｙｍａｙｕｎｄｅｒｅｓｔｉｍａｔｅｔｈｅｉｒ

ｐｏｔｅｎｔｉａｌｈａｒｍｆｕｌｎｅｓｓ．Ｔｈｉｓｉｓｅｖｅｎｍｏｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｔｓｅｎｄａｎｇｅｒａｎｄｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｓｏｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｒｅｓｅａｒｃｈｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｏｍｅｃｏｍｍｏｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｓｔｒｏｇｅｎｍｉｘｅｄ．

Ｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｄｈｅｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄＷｅｇａｉｎｅｄｔｌｊ曲ｐｕｒｉｔｙＳｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌｓｉｎｍｉｃｅ；Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｎｓｉｔｙ（１０－９，１０－７＇１０一ｔｏｏｌ／Ｌ）ＢＰＡ、

Ｓｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ、ｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｏｆＢＰＡａｎｄＳｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ、ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｓｔｒｏｇｅｎａｎｄ

ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅｍｉｘｅｄｗｅｒｅｊｏｉｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅＤＭＥＭｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｉｎｖｉｔｒｏｔｏｉｎｄｕｃｅＳｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌｓ．Ｗｅ

ｕｓｅｄｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃｌ－２

ｆａｍｉｌｉｅｓ’ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ：

１．Ｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｄｈｅｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｓｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌｓｒｅａｃｈｅｄ９０％ｈｉｇｈｅｒ２．Ｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ＢＰＡｏｒＳｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ．ｍｔｈｅｌｏｗｄｏｓａｇｅ（１０－９ｍｏｌ／Ｌ）ｉｎｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆ

ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｗａｓｉｎｃｒｅａｓｄ，ｉｎＢｃｌ·２ｆａｍｉｌｉｅｓ’ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｒｌａＩｏｆＢａｘＷａｓ

ｗｅａｋ，ａｎｄＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＢｃｌ一２Ｗａｓｉｎｃｒｅａｓｄ；ＷｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＢＰＡ、Ｓｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ，ｔｈｅｓｉｇｎａｌｏｆＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｄｅｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｉｎＢｃｌ－２ｆａｍｉｌｉｅｓ’

ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｓｉｇｎａｌｏｆＢａｘｇｒａｄｕａｌｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ、ｔｈｅｓｉｇｎａｌｏｆＢｃｌ一２ｄｅｃｒｅａｓｅｄ

ｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅＳｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｍａｙｂｅａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙｔｈｅｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢＰＡｏｒＳｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓＷａＳ

ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅｈｉ．ｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｇｅｎｔｓ。３．ＩｎｔｈｅＢＰＡａｎｄＳｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｃｏ－ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｌｏｗ—ｄｏｓｅｏｆａｄｉｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（１旷

ｍｏｌ／Ｌ）ｃａｕｓｅｄ，ｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｓＷｅａｋ，ｉｎＢｅｌ一２ｆａｍｉｌｙ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＢａｘｉｓＷｅａｋ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＢｃｌ－２ｉｓｓ仃ｏｎｇ；Ｈｏｗｅｖｅｒ，ａｆｔｅｒｔｈｅｃｏ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂｏｔｈａｇｅｎｔｓａｔｈｉｇｈｅｒ－ｄｏｓｅｓ（１ｆｆ５ｍｏｌ／Ｌ），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

１１１东北农业大学理学硕士学位论文

ｓｉｇｎａｌｏｆＣｙｔｏｅｈｒｏｍｅＣｗａｓｍａｒｋｅｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｄ，ｉｎＢｅｌ－２ｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＢａｘＷａＳｍａｒｋｅｄｌｙｄｅｃｒｅａｓｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＢｃｌ一２ｗａｓｍａｒｋｅｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｄ，

ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇａｌｌｏｖｅｒｌａｙｅｆｆｅｃｔｏｆＢＰＡｗｉｔｈＳｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓａｔｌｏｗｄｏｓｅ，ａｎｄａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ

ｅｆｆｅｃｔａｔｈｉｇｈｅｒ－ｄｏｓｅ．４．Ｉｎｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｓ仃ｏｇｅｎａｎｄｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅｃｏ－ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ（１０－’ｍｏｌ／Ｌ），ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ

ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｍａｒｋｅｄｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄ，ｉｎＢｃｌ－２ｆａｍｉｌｉｅｓ’

ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＢａｘｉｓｃｌｅａｒｌｙｄｅｃｒｅａｓｄ、ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＢｃｌ－２

ｍａｒｋｅｄｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｓｔｒｏｇｅｎａｎｄｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅａｐｐｅａｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ

ｐｈｅｎｏｍｅｎａ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈａｔ，ＴｈｅｓｉｇｎａｌｒｏｌｅｏｆＢＰＡｏｒＳｏｙｂｅａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｔｏｍｏｕｓｅＳｅｒｔｏｌｉ