常见猪病检测方法
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猪病诊断技术规范
一、致病性大肠杆菌的检测
1引用标准
参考NY/T555-2002（动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法）。
2范围
适用于猪大肠杆菌病的诊断。
3检测方法
3.1材料
3.1.1营养肉汤
3.1.2营养琼脂
3.1.3EMB
3.1.4TSI
3.1.5IMViC生化鉴定管
3.1.6小白鼠
3.2分离培养
a) 将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板（同时接种营养肉汤增菌备用），置37℃培养18~24h。
b) 观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜检。
c) 如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌，应取5~10个典型菌落再接种于TSI琼脂。
d) 同时挑取典型菌落接种营养琼脂，37℃培养16~18h的菌液用于生化特性鉴定。
3.3生化鉴定
挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管，(36±1)℃培养24h后观察结果。
3.3.1靛基质试验：
a) 滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。
b) 出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。 3.3.2甲基红（MR）试验
a) 滴加甲基红指示剂0.2mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。
b) 出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。
3.3.3 VP试验
a) 滴加VP试剂甲液0.2mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1mL混匀，静置，观察结果。
b) 在15min内出现红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1h后再观察一次，出现红色也为阳性反应。
3.3.4枸橼酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。
3.4大肠杆菌鉴定结果
应符合表1要求。
表1大肠杆菌鉴定结果
靛基质 MR VP 枸橼酸盐 鉴定
+ + - - 典型大肠埃希氏杆菌
- + - - 非典型大肠埃希氏杆菌
+ + - + 典型柠檬酸盐杆菌
- + - + 非典型柠檬酸盐杆菌
- - - + 典型产气杆菌
+ - - + 非典型产气杆菌
出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。
3.4致病性试验
a) 取经营养肉汤37℃培养16~18h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重20g左右的小白鼠，每株接种2~3只，每只0.3mL（含菌量约为1×1012cfu／mL），同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。
b) 饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。在24小时内出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。
4药敏试验 a) 挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，37℃培养16~18h，菌液用于药敏试验。
b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5张，置37℃培养24ｈ后观察。
c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。
二、沙门氏菌的检测
1引用标准
参考NY/T550-2002（动物和动物产品沙门氏菌检测方法）。
2范围
适用于猪沙门氏菌病的诊断。
3检测方法
3.1材料
3.1.1SC
3.1.2DHL
3.1.3TSI
3.1.4赖氨酸脱羧酶（LD）
3.1.5邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（DNPG）
3.1.6甘露醇糖发酵管
3.2分离培养
a) 采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。
b) 无菌剪取肝、脾样品1g，投入10mLSC增菌液中（血液、粪便样品可以采适量直接投入10mL增菌液），36±1℃培养18~24h。
c) 取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上，36±1℃培养18~24h。观察平板上菌落生长形态。沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明，产硫化氢（H2S），菌落中心黑色或几乎全黑色。
3.3生化鉴定
a) 挑取DHL平板上可疑菌落3~5个，每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中，继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。 b) 再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验（LD）和ONPG，甘露醇糖发酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管，36±1℃培养18~24h（挑取菌落后的平板，应置于4℃冰箱保留48h以备复查）。
c) 按表1记录反应结果，对照表2进行判定。
d) 凡符合表2生化反应模式，可报告为沙门氏菌。
表1生化反应结果判定
生化管 TSI LD ONPG MAN 底a 斜面b 硫化氢
第一次颜色
记录符合 黄
+ 黄
+ 黑
+ 紫
+ 深黄
+ 黄
+
第二次颜色
记录符号 红
- 红
- 无黑色
- 黄
- 无色或淡黄
- 紫
-
a“底”观察葡萄糖反应。
b“斜面”观察乳糖和蔗糖反应。
表2生化检测沙门氏菌属判定表
序
号 TSI
LD ONPG MAN 判定 底 斜面 硫化氢
A
Ba
C
Db
Ec
Fd
G +
+
+
+
+
+
- -
+
-
-
-
-
+- +
+
+
+
-
-
- +
+
+
-
+
-
+- -
+
+
-
-
-
+ +
+
+
+
+
+
+- 沙门氏菌亚种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ
沙门氏菌亚种Ⅲb、15％Ⅲa
沙门氏菌亚种Ⅲa、Ⅴ、15％Ⅲb、15％Ⅱ
少数沙门氏菌亚种Ⅰ
少数沙门氏菌亚种Ⅰ
甲型副伤寒沙门氏菌
非沙门氏菌
a含1％硫化氢阳性的大肠埃希氏菌，可加试靛基质加以鉴别，其中大肠杆菌阳性，沙门氏菌阴性。
b赖氨酸阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种、鸡等。
c硫化氢阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱、猪伤寒、仙台、贝塔、巴布亚、鸡、马流产、山夫登堡、都柏林登。。
d可直接用（O）单因子血清证实，以排除雷极氏普罗菲登斯菌登。
4药敏试验
a) 挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，36±1℃培养16~18h，菌液用于药敏试验。 b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5张，置36±1 ℃培养24ｈ后观察。
c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。
三、产气荚膜梭菌的检测
1引用标准
自定标准。
2范围
适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。
3材料
3.1绵羊血琼脂
3.2牛乳培养基。
4组织染色镜检
对疑似病例的肠道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直杆状，两端钝圆，单在或成双，无鞭毛，不运动。芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，多数菌株可形成荚膜。
5分离培养
可将肠道内容物接种血平板，37 ℃厌氧培养18～24h后观察。菌落特点：魏氏梭菌在血平板上可形成直径2～5mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落，有双层溶血环。可通过镜检对形态进一步确定。
6生化鉴定
对牛乳培养基的“暴烈发酵”。
7肠内毒素检查
采集空肠后段或结肠前段内容物，加适量生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份加热（60 ℃30min）。两份上清液分别静脉注射家兔（1～3ml）或小鼠（0.1～0.3ml）。如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。
8报告 因为正常人畜肠道内存在此菌，并且发病菌主要靠在肠道内产生毒素致病，细菌本身并不侵入机体。因此只有细菌分离和肠毒素检查都符合，并结合临床症状才能报告产气荚膜梭菌感染。鉴别A型和C型要靠中和保护试验。
四、猪痢疾诊断
1引用标准
参考NY/T545-2002。
2范围
适用于猪痢疾（SD）的实验室诊断。
3粪便中Sh显微镜检查
3.1材料
3.1.1器材：显微镜，暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等
3.1.2染色液：结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。
3.1.3样品：病猪新鲜粪便（含粘）或直肠拭子或大肠内容物及黏膜
3.2操作方法
3.2.1min~3min，水洗，吸干后待检。
3.2.3悬滴样品制作：取样品少许悬于生理盐水，待检。
每份样品最少制片2张
3.2.4显微镜检查：染色样品以油镜直接观察，悬滴样品在暗视野400~1000倍镜头下观察。
3.3结果判定
典型Sh菌体长6μm~8.5μm，呈2~5个密螺旋体，两端尖锐，呈蛇样活泼运动。当视野中有数量（3~5条以上）Sh样菌体时，在获培养前，可作为诊断的重要参考。
4分离培养和鉴定
4.1材料准备
4.1.1器材：厌氧培养装置及使用方法，细菌学实验常规器材，外科手术器材，微孔滤器和0.65μm滤膜。
4.1.2试验动物：小鼠（20 g左右）
4.1.3试剂：PBS(0.01M，pH7.2)，生理盐水，多粘菌素，TSA。
