红外光谱酰胺_带用于蛋白质二级结构的测定研究
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收稿日期: 2002202205. 基金项目: 国家自然科学基金 ( 批准号: 39825112) 资助. 联系人简介: 谢孟峡 (1962 年出生) , 男, 硕士, 副教授, 主要从事色谱及有机波谱研究. E 2 m ail: m engx ia2x ie@ 263. net
N o. 2
谢孟峡等: 红外光谱酰胺
～ 1 220 cm - 1 为 Β2折叠. 依据这些谱峰归属, 对一些已知二级结构的蛋白质进行了测 cm - 1 为无规卷曲; 1 250 带的定量结果基本一致. 带; 蛋白质二级结构; 溶剂变性 关键词 傅里叶变换红外光谱 ( FT IR ) ; 酰胺
中图分类号 O 657. 7 文献标识码 A 文章编号 025120790 ( 2003) 0220226206
228
高等学校化学学报
. 24 Vol
谱拟合结果显示, 1 320, 1 312 和 1 297 cm - 1 归属为 Α 2螺旋结构, Α 2螺旋所占的比例为 23% 左右 . 溶剂 变性后, R nase A 的 Α 2螺旋结构的比例从 23. 3% 逐渐减少到 19. 2% , 与酰胺 带拟合结果相近 ( 见表 2). 谱峰的峰位在 1 330 ～ 1 294 cm - 1 之间 [ 见图 2 (B ) ].
Vol . 24
2 0 0 3年2月
高等学校化学学报
CH EM ICAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ER S IT IES
N o. 2
226 ～ 231
红外光谱酰胺 带用于蛋白质 二级结构的测定研究
谢孟峡, 刘 媛
( 北京师范大学分析测试中心, 北京 100875)
2 结果与讨论
2. 1 酰胺
带的谱峰归属 蛋白质分子受到一些外界因素的影响会发生变性, 变性作用的实质是蛋白质分子空间结构的改变 和破坏 . 有机溶剂是引起蛋白质分子变性作用的因素之一, 随着有机溶剂比例的增加, 蛋白质的有序 结构逐渐向无序结构转化[ 17～ 19 ]. 甲醇在酰胺 带和酰胺 带没有吸收峰, 作为变性溶剂可以减少本身 对蛋白质谱带的影响, 使所得结果真实可信. 变性蛋白选用 Α 2螺旋较高的 B SA 和 Β2折叠含量较高的 R nase A. 对于 B SA , 分别在甲醇体积分数为 20% , 30% , 40% 及 50% 的缓冲液体系中溶解并测定其 红外光谱, R nase A 分别在甲醇体积分数为 20% , 30% 及 40% 的缓冲液体系中溶解并测定其红外光 谱 . 由于 R nase A 的 Β2折叠含量较高, 在甲醇体积分数高于 40% 的缓冲体系中, 蛋白质发生聚合并出 现沉淀, 在光谱测定中, 谱图发生变化. B SA 在甲醇体积分数大于 50% 时会出现同样的现象 . B SA 在 甲醇体积分数为 50% 和 R nase A 在甲醇体积分数为 40% 的缓冲液体系中变性后酰胺 带和酰胺 带 的曲线拟合谱分别见图 1 和图 2. 表 1 给出 B SA 和 R nase A 在缓冲液体系中和甲醇变性溶剂中酰胺 带各子峰的归属. 表 1 数据为 3 次测定结果的平均值 ( 其偏差已注明) , 各子峰峰位偏差均在 2 cm - 1 以 内 . 2. 1. 1 Α 2螺旋 对 B SA 的原谱进行曲线拟合, 1 324, 1 316, 1 305 和 1 293 cm - 1 的谱峰归属为 Α 2螺旋 [ 9, 17 ] 结构, 所占的比例为 48% 左右, 与文献报道 以及酰胺 带的拟合结果一致 . 随着溶剂中甲醇比例 的增加, Α 2螺旋的相对百分含量逐渐减少, 当加入甲醇的体积分数为由 0 增加到 50% 时, B SA 螺旋的 含量由 48. 4% 下降到 38. 3% , 这和酰胺 带拟合的结果相匹配 ( 见表 2 ) , 谱峰的峰位均在 1 330～ 1 295 cm - 1 范围内 [ 图 1 (B ) ]. R nase A 的 X 射线衍射数据表明其含有 23% 的螺旋结构, 其酰胺 带原
1. 2. 1 蛋白质溶液的配制 缓冲体系为 20 mm o l L 的 N aH 2 PO 4 水溶液, 用浓 N aOH 溶液调节 pH 值
为 7. 4, 以此缓冲溶液溶解蛋白质, 蛋白质的质量体积分数为 2%. 将甲醇和缓冲溶液按一定的体积比 混合, 并确保最终混合溶剂中 N aH 2 PO 4 的浓度为 20 mm o l L , 以该混合溶剂溶解蛋白质, 使蛋白质的 质量体积分数为 2%. 1. 2. 2 谱图收集 在与样品测定完全相同的环境下, 将在 4 cm - 1 分辨率及扫描 2 048 次收集的水蒸 汽的谱图作为水汽校正的参考光谱, 使用 OM N IC 5. 2 数据处理软件自动进行水汽校正 . 室温下敞开 状态收集背景, 然后将样品溶液均匀地铺满 A TR 的 ZeSe 晶片, 在 4 cm - 1 分辨率下, 扫描 512 次, 收 集样品光谱. 1. 2. 3 谱图处理 蛋白溶液的谱图差减不含蛋白质的空白溶液谱图, 差减的程度以谱图在 1 800 ～ - 1 [ 11 ] - 1 2 200 cm 呈一条平滑直线为原则 . 差减后的谱图在谱带范围内 ( 酰胺 带 1 600 ～ 1 700 cm ; 酰 - 1 胺 带 1 220 ～ 1 330 cm ) 进行两点基线校正, 采用 5 点 Savitsk 2Go lay 函数平滑后, 做二阶导数和傅 里叶去卷积, 从而可以估计出各子峰的峰位和半峰宽 . 手动选定各子峰的峰位和峰宽, 采用 Gausse 函 数对谱图进行拟合, 多次拟合使残差最小. 重叠在一起的不同谱带可完全分辨开, 当确定了各子峰与 不同二级结构的对应关系后, 根据其积分面积计算各种二级结构的相对百分含量 .
摘要 用甲醇对 B SA 和 R ase A 等蛋白质进行变性处理, 结合蛋白质酰胺 级结构的谱峰进行了初步指认: 1 330 ～ 1 290 cm 定, 所得结果与 X 射线衍射数据以及酰胺
- 1
带的拟合结果对酰胺
- 1
带各二
为Α 2螺旋; 1 295 ～ 1 265 cm
为 Β2转角; 1 270 ～ 1 245
Table 1 The in f luence of organ ic solven t on the secondary structure of BSA and Rna se A
P ro tein BSA Peak Po sition cm - 1 1 324 1 316 1 305 1 293 1 282 1 271 1 262 1 254 1 245 1 237 1 229 BSA 2 20% CH 3OH 1 323 1 316 1 307 1 296 1 284 1 275 1 265 1 256 1 244 1 235 1 227 BSA 2 30% CH 3OH 1 324 1 316 1 306 1 295 1 286 1 276 1 266 1 255 1 243 1 234 1 229 BSA 2 40% CH 3OH 1 323 1 316 1 307 1 296 1 284 1 275 1 264 1 253 1 243 1 234 1 227 BSA 2 50% CH 3OH 1 322 1 316 1 309 1 299 A rea (% ) 1. 80±0. 2 12. 17±0. 3 12. 45±0. 5 21. 94±0. 1 6. 29±0. 4 12. 84±0. 2 4. 97±0. 3 6. 83±0. 1 12. 88±0. 5 5. 58±0. 1 2. 25±0. 2 2. 8±0. 3 9. 0±0. 4 10. 2±1. 3 22. 1±0. 1 9. 2±0. 7 9. 8±0. 2 8. 2±0. 4 8. 3±0. 2 13. 6±0. 2 5. 3±0. 4 1. 4±0. 6 2. 3±0. 4 9. 0±0. 1 15. 0±0. 2 16. 2±0. 4 9. 9±0. 8 10. 4±0. 1 9. 2±0. 1 8. 0±0. 2 15. 8±0. 4 3. 0±0. 5 1. 3±0. 2 1. 7±0. 1 11. 5±0. 2 9. 2±0. 1 18. 9±0. 4 12. 6±0. 4 8. 2±0. 7 9. 5±0. 1 8. 8±0. 1 12. 7±0. 2 5. 5±0. 2 1. 4±0. 2 3. 8±0. 1 6. 5±0. 3 10. 0±0. 2 18. 1±0. 4 A ssignm en t of Con ten t of the componen t secondary peak s structure (% ) P ro tein BSA 2 50% CH 3OH Peak Po sition cm - 1 1 287 1 276 1 265 1 251 19. 1±0. 6 11. 8±0. 4 20. 7±0. 8 R nase A 1 242 1 235 1 228 1 320 1 312 1 297 1 286 44. 3±2. 1 1 270 1 261 1 255 1 245 18. 9±0. 9 16. 5±0. 6 20. 3±1. 2 R nase A 2 20% CH 3OH 1 235 1 228 1 318 1 306 1 294 1 285 1 270 42. 5±1. 1 1 262 1 256 1 245 1 236 20. 2±0. 9 R nase A 2 17. 1±0. 3 20. 2±1. 1 30% CH 3OH 1 228 1 322 1 312 1 298 1 286 1 272 1 262 41. 3±0. 8 1 253 1 244 1 234 1 228 20. 8±1. 1 18. 3±0. 2 19. 6±0. 6 R nase A 2 40% CH 3OH 1 322 1 314 1 302 1 288 1 270 1 261 1 252 38. 3±1. 0 1 244 1 236 1 228 A rea (% ) 13. 8±0. 5 8. 3±0. 2 13. 2±0. 2 10. 2±0. 6 9. 9±0. 5 4. 4±0. 3 1. 8±0. 2 4. 7±0. 2 11. 8±0. 5 6. 8±0. 1 7. 3±0. 3 11. 3±0. 6 8. 7±0. 1 2. 9±0. 3 31. 9±0. 4 10. 6±0. 2 4. 1±0. 1 10. 2±0. 4 7. 5±0. 4 3. 5±1. 0 7. 0±1. 3 14. 2±0. 5 4. 6±0. 4 8. 7±0. 8 29. 7±0. 5 11. 5±0. 2 3. 0±1. 3 2. 8±0. 1 14. 1±0. 7 3. 7±0. 8 7. 2±1. 0 15. 0±0. 1 6. 9±0. 8 10. 0±0. 2 29. 3±1. 2 6. 7±0. 2 4. 4±0. 7 3. 2±0. 5 11. 6±0. 7 4. 4±0. 1 10. 8±0. 6 12. 3±0. 0 10. 3±0. 7 12. 3±1. 9 23. 1±0. 8 9. 3±0. 9 2. 6±0. 6 A ssignm en t of Con ten t of the componen t secondary peak s structure (% )
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谢孟峡等: 红外光谱酰胺
～ 1 220 cm - 1 为 Β2折叠. 依据这些谱峰归属, 对一些已知二级结构的蛋白质进行了测 cm - 1 为无规卷曲; 1 250 带的定量结果基本一致. 带; 蛋白质二级结构; 溶剂变性 关键词 傅里叶变换红外光谱 ( FT IR ) ; 酰胺
中图分类号 O 657. 7 文献标识码 A 文章编号 025120790 ( 2003) 0220226206
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高等学校化学学报
. 24 Vol
谱拟合结果显示, 1 320, 1 312 和 1 297 cm - 1 归属为 Α 2螺旋结构, Α 2螺旋所占的比例为 23% 左右 . 溶剂 变性后, R nase A 的 Α 2螺旋结构的比例从 23. 3% 逐渐减少到 19. 2% , 与酰胺 带拟合结果相近 ( 见表 2). 谱峰的峰位在 1 330 ～ 1 294 cm - 1 之间 [ 见图 2 (B ) ].
Vol . 24
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高等学校化学学报
CH EM ICAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ER S IT IES
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226 ～ 231
红外光谱酰胺 带用于蛋白质 二级结构的测定研究
谢孟峡, 刘 媛
( 北京师范大学分析测试中心, 北京 100875)
2 结果与讨论
2. 1 酰胺
带的谱峰归属 蛋白质分子受到一些外界因素的影响会发生变性, 变性作用的实质是蛋白质分子空间结构的改变 和破坏 . 有机溶剂是引起蛋白质分子变性作用的因素之一, 随着有机溶剂比例的增加, 蛋白质的有序 结构逐渐向无序结构转化[ 17～ 19 ]. 甲醇在酰胺 带和酰胺 带没有吸收峰, 作为变性溶剂可以减少本身 对蛋白质谱带的影响, 使所得结果真实可信. 变性蛋白选用 Α 2螺旋较高的 B SA 和 Β2折叠含量较高的 R nase A. 对于 B SA , 分别在甲醇体积分数为 20% , 30% , 40% 及 50% 的缓冲液体系中溶解并测定其 红外光谱, R nase A 分别在甲醇体积分数为 20% , 30% 及 40% 的缓冲液体系中溶解并测定其红外光 谱 . 由于 R nase A 的 Β2折叠含量较高, 在甲醇体积分数高于 40% 的缓冲体系中, 蛋白质发生聚合并出 现沉淀, 在光谱测定中, 谱图发生变化. B SA 在甲醇体积分数大于 50% 时会出现同样的现象 . B SA 在 甲醇体积分数为 50% 和 R nase A 在甲醇体积分数为 40% 的缓冲液体系中变性后酰胺 带和酰胺 带 的曲线拟合谱分别见图 1 和图 2. 表 1 给出 B SA 和 R nase A 在缓冲液体系中和甲醇变性溶剂中酰胺 带各子峰的归属. 表 1 数据为 3 次测定结果的平均值 ( 其偏差已注明) , 各子峰峰位偏差均在 2 cm - 1 以 内 . 2. 1. 1 Α 2螺旋 对 B SA 的原谱进行曲线拟合, 1 324, 1 316, 1 305 和 1 293 cm - 1 的谱峰归属为 Α 2螺旋 [ 9, 17 ] 结构, 所占的比例为 48% 左右, 与文献报道 以及酰胺 带的拟合结果一致 . 随着溶剂中甲醇比例 的增加, Α 2螺旋的相对百分含量逐渐减少, 当加入甲醇的体积分数为由 0 增加到 50% 时, B SA 螺旋的 含量由 48. 4% 下降到 38. 3% , 这和酰胺 带拟合的结果相匹配 ( 见表 2 ) , 谱峰的峰位均在 1 330～ 1 295 cm - 1 范围内 [ 图 1 (B ) ]. R nase A 的 X 射线衍射数据表明其含有 23% 的螺旋结构, 其酰胺 带原
1. 2. 1 蛋白质溶液的配制 缓冲体系为 20 mm o l L 的 N aH 2 PO 4 水溶液, 用浓 N aOH 溶液调节 pH 值
为 7. 4, 以此缓冲溶液溶解蛋白质, 蛋白质的质量体积分数为 2%. 将甲醇和缓冲溶液按一定的体积比 混合, 并确保最终混合溶剂中 N aH 2 PO 4 的浓度为 20 mm o l L , 以该混合溶剂溶解蛋白质, 使蛋白质的 质量体积分数为 2%. 1. 2. 2 谱图收集 在与样品测定完全相同的环境下, 将在 4 cm - 1 分辨率及扫描 2 048 次收集的水蒸 汽的谱图作为水汽校正的参考光谱, 使用 OM N IC 5. 2 数据处理软件自动进行水汽校正 . 室温下敞开 状态收集背景, 然后将样品溶液均匀地铺满 A TR 的 ZeSe 晶片, 在 4 cm - 1 分辨率下, 扫描 512 次, 收 集样品光谱. 1. 2. 3 谱图处理 蛋白溶液的谱图差减不含蛋白质的空白溶液谱图, 差减的程度以谱图在 1 800 ～ - 1 [ 11 ] - 1 2 200 cm 呈一条平滑直线为原则 . 差减后的谱图在谱带范围内 ( 酰胺 带 1 600 ～ 1 700 cm ; 酰 - 1 胺 带 1 220 ～ 1 330 cm ) 进行两点基线校正, 采用 5 点 Savitsk 2Go lay 函数平滑后, 做二阶导数和傅 里叶去卷积, 从而可以估计出各子峰的峰位和半峰宽 . 手动选定各子峰的峰位和峰宽, 采用 Gausse 函 数对谱图进行拟合, 多次拟合使残差最小. 重叠在一起的不同谱带可完全分辨开, 当确定了各子峰与 不同二级结构的对应关系后, 根据其积分面积计算各种二级结构的相对百分含量 .
摘要 用甲醇对 B SA 和 R ase A 等蛋白质进行变性处理, 结合蛋白质酰胺 级结构的谱峰进行了初步指认: 1 330 ～ 1 290 cm 定, 所得结果与 X 射线衍射数据以及酰胺
- 1
带的拟合结果对酰胺
- 1
带各二
为Α 2螺旋; 1 295 ～ 1 265 cm
为 Β2转角; 1 270 ～ 1 245
Table 1 The in f luence of organ ic solven t on the secondary structure of BSA and Rna se A
P ro tein BSA Peak Po sition cm - 1 1 324 1 316 1 305 1 293 1 282 1 271 1 262 1 254 1 245 1 237 1 229 BSA 2 20% CH 3OH 1 323 1 316 1 307 1 296 1 284 1 275 1 265 1 256 1 244 1 235 1 227 BSA 2 30% CH 3OH 1 324 1 316 1 306 1 295 1 286 1 276 1 266 1 255 1 243 1 234 1 229 BSA 2 40% CH 3OH 1 323 1 316 1 307 1 296 1 284 1 275 1 264 1 253 1 243 1 234 1 227 BSA 2 50% CH 3OH 1 322 1 316 1 309 1 299 A rea (% ) 1. 80±0. 2 12. 17±0. 3 12. 45±0. 5 21. 94±0. 1 6. 29±0. 4 12. 84±0. 2 4. 97±0. 3 6. 83±0. 1 12. 88±0. 5 5. 58±0. 1 2. 25±0. 2 2. 8±0. 3 9. 0±0. 4 10. 2±1. 3 22. 1±0. 1 9. 2±0. 7 9. 8±0. 2 8. 2±0. 4 8. 3±0. 2 13. 6±0. 2 5. 3±0. 4 1. 4±0. 6 2. 3±0. 4 9. 0±0. 1 15. 0±0. 2 16. 2±0. 4 9. 9±0. 8 10. 4±0. 1 9. 2±0. 1 8. 0±0. 2 15. 8±0. 4 3. 0±0. 5 1. 3±0. 2 1. 7±0. 1 11. 5±0. 2 9. 2±0. 1 18. 9±0. 4 12. 6±0. 4 8. 2±0. 7 9. 5±0. 1 8. 8±0. 1 12. 7±0. 2 5. 5±0. 2 1. 4±0. 2 3. 8±0. 1 6. 5±0. 3 10. 0±0. 2 18. 1±0. 4 A ssignm en t of Con ten t of the componen t secondary peak s structure (% ) P ro tein BSA 2 50% CH 3OH Peak Po sition cm - 1 1 287 1 276 1 265 1 251 19. 1±0. 6 11. 8±0. 4 20. 7±0. 8 R nase A 1 242 1 235 1 228 1 320 1 312 1 297 1 286 44. 3±2. 1 1 270 1 261 1 255 1 245 18. 9±0. 9 16. 5±0. 6 20. 3±1. 2 R nase A 2 20% CH 3OH 1 235 1 228 1 318 1 306 1 294 1 285 1 270 42. 5±1. 1 1 262 1 256 1 245 1 236 20. 2±0. 9 R nase A 2 17. 1±0. 3 20. 2±1. 1 30% CH 3OH 1 228 1 322 1 312 1 298 1 286 1 272 1 262 41. 3±0. 8 1 253 1 244 1 234 1 228 20. 8±1. 1 18. 3±0. 2 19. 6±0. 6 R nase A 2 40% CH 3OH 1 322 1 314 1 302 1 288 1 270 1 261 1 252 38. 3±1. 0 1 244 1 236 1 228 A rea (% ) 13. 8±0. 5 8. 3±0. 2 13. 2±0. 2 10. 2±0. 6 9. 9±0. 5 4. 4±0. 3 1. 8±0. 2 4. 7±0. 2 11. 8±0. 5 6. 8±0. 1 7. 3±0. 3 11. 3±0. 6 8. 7±0. 1 2. 9±0. 3 31. 9±0. 4 10. 6±0. 2 4. 1±0. 1 10. 2±0. 4 7. 5±0. 4 3. 5±1. 0 7. 0±1. 3 14. 2±0. 5 4. 6±0. 4 8. 7±0. 8 29. 7±0. 5 11. 5±0. 2 3. 0±1. 3 2. 8±0. 1 14. 1±0. 7 3. 7±0. 8 7. 2±1. 0 15. 0±0. 1 6. 9±0. 8 10. 0±0. 2 29. 3±1. 2 6. 7±0. 2 4. 4±0. 7 3. 2±0. 5 11. 6±0. 7 4. 4±0. 1 10. 8±0. 6 12. 3±0. 0 10. 3±0. 7 12. 3±1. 9 23. 1±0. 8 9. 3±0. 9 2. 6±0. 6 A ssignm en t of Con ten t of the componen t secondary peak s structure (% )
