制备细胞爬片1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。
再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。
将培养皿（6孔细胞培养板）置于37℃，含5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。
2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。
3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。
4、倾去培养液，加PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片2 次，每次1 min。
5、加10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定10～15min。
6、吸除固定液，加PBS 再洗涤细胞爬片3 次，每次5 min。
7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。
8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。
将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。
免疫荧光双染用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案1)冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定10～15min。
（细胞爬片固定后，以下步骤一样）2)漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。
PBS液是用来漂洗和稀释的。
其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。
3)在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。
（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟4)阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。
（37℃）（一抗前不洗，只甩干）5)原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
第52卷 第5期2024年5月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .5M a y 2024网络出版时间:2023-11-01 12:13 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.05.014网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20231031.1645.013桂花O fW R K Y 120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究[收稿日期] 2023-03-02[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(32071828);江苏高校优势学科建设工程资助项目 [作者简介] 宰舟颖(1999-),女,安徽天长人,在读硕士,主要从事园林植物遗传育种研究㊂E -m a i l :a z d z w y36@163.c o m [通信作者] 杨秀莲(1970-),女,浙江诸暨人,教授,博士,主要从事园林植物生理和栽培应用研究㊂E -m a i l :x l y @n jf u .e d u .c n 宰舟颖1,王柳1,丁卉芬1,杨展栋1,王良桂1,2,岳远征1,杨秀莲1(1南京林业大学风景园林学院,江苏南京210037;2南方现代林业协同创新中心,江苏南京210037)[摘 要] ʌ目的ɔ根据前期基因家族鉴定分析得到O f W R K Y120,对该基因盐胁迫响应的功能进行分析,为桂花盐胁迫下的调控机制研究奠定基础㊂ʌ方法ɔ利用生物信息学方法对O f W R K Y120保守结构域㊁系统进化进行分析,并采用q R T -P C R 技术研究盐胁迫下O f W R K Y 120在桂花叶片中的相对表达量㊂构建O f W R K Y 120超表达载体,使用亚细胞定位㊁酵母自激活检测等探究其特性,将该基因瞬时转化本氏烟草后,对烟草进行盐处理,利用D A B ㊁N B T 染色和相关生理指标的测定,解析瞬时转化O f W R K Y 120对本氏烟草耐盐性的影响㊂ʌ结果ɔO f W R K Y120基因全长为1422b p ,编码474个氨基酸,存在WR K Y s u p e r f a m i l y 保守结构域㊂盐胁迫能够激活桂花叶片中O f-W R K Y 120的表达,在72h 时相对表达量最高,与对照有显著差异㊂亚细胞定位结果表明,O f WR K Y 120定位于细胞核㊂酵母自激活结果显示O f WR K Y 120无自激活活性㊂盐胁迫后,O f W R K Y120瞬时过表达植株的超氧阴离子(O -㊃2)和脯氨酸含量显著高于空载对照,且D A B 和N B T 染色表现出更深的颜色㊂本氏烟草中的q R T -P C R 结果显示,O f W R K Y120显著降低了N b C A T 的表达,而显著提高了N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2和N b P 5C R 的表达㊂ʌ结论ɔO f W R K Y120过表达增加了盐胁迫下本氏烟草中活性氧(R O S )的含量,导致植物对盐胁迫的敏感性提高㊂[关键词] 桂花;O f W R K Y120基因;盐胁迫;抗逆育种[中图分类号] S 685.13[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)05-0144-11I d e n t i f i c a t i o n a n d s a l t s t r e s s r e s po n s e o f O f W R K Y 120g e n e i n O s m a n t h u s f r a gr a n s Z A I Z h o u y i n g 1,WA N G L i u 1,D I N G H u i f e n 1,Y A N G Z h a n d o n g 1,WA N G L i a n g gu i 1,2,Y U E Y u a n z h e n g 1,Y A N G X i u l i a n 1(1C o l l e g e o f L a n d s c a p e A r c h i t e c t u r e ,N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g ,J i a n gs u 210037,C h i n a ;2C o -I n n o v a t i o n C e n t e r f o r S u s t a i n a b l e F o r e s t r y ,N a n j i n g ,J i a n gs u 210037,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔA c c o r d i n g t o p r e v i o u s g e n e f a m i l y i d e n t i f i c a t i o n a n a l ys i s ,a WR K Y g e n e o f O s -m a n t h u s f r a g r a n s n a m e d O f WR K Y120w a s o b t a i n e d a n d t h e r e s p o n s e t o s a l t s t r e s s w a s a n a l y z e d t o p r o -v i d e b a s i s f o r f u r t h e r a n a l y s i s o f t h e r e g u l a t o r y me c h a n i s m u n d e r s a l t s t r e s s .ʌM e t h o d ɔT h e c o n s e r v e d d o -m a i n a n d p h y l o g e n e t i c s of O f WR K Y120w e r e a n a l y z e d b y b i o i n f o r m a t i c s m e t h o d s ,a n d q R T -P C R w a s u s e d t o a n a l y z e t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f O f WR K Y 120i n O .f r a gr a n s l e a v e s u n d e r s a l t s t r e s s .A s u p e r -e x p r e s -s i o n v e c t o r o f O f WR K Y120w a s c o n s t r u c t e d a n d s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a n d a u t o a c t i v a t i o n d e t e c t i o n w e r e c a r r i e d o u t t o e x p l o r e t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g e n e .T h e e f f e c t o f O f WR K Y120o n s a l t t o l e r a n c e w a s a n a -l y z e d b y t r e a t i n g N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a w i t h s a l t ,d e t e r m i n i n g r e l e v a n t p h y s i o l o gi c a l i n d e x e s ,a n d p e r -f o r m i ng D A B&N B T s t a i n i n g.ʌR e s u l tɔTh e O f WR K Y120g e n e w a s1422b pi n l e n g t h,e n c o d i n g474a m i-n o a c i d s w i t h a c o n s e r v e d WR K Y s u p e r f a m i l y.S a l t s t r e s s a c t i v a t e d t h e e x p r e s s i o n o f O f WR K Y120i n O.f r ag r a n s,a n d th e r e l a ti v e e x p r e s s i o n w a s t h e h i g h e s t a t72h w i t h s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m t h e c o n t r o l. S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n r e s u l t s s h o w e d t h a t O f WR K Y120w a s l o c a t e d i n t h e n u c l e u s.Y e a s t a u t o a c t i v a t i o n r e s u l t s s h o w e d n o a u t o a c t i v a t i o n a c t i v i t y o f O f WR K Y120.A f t e r s a l t t r e a t m e n t,t h e c o n t e n t s o f s u p e r o x i d e a n i o n(O-㊃2)a n d p r o l i n e i n t r a n s g e n i c l e a v e s w i t h O f WR K Y120o v e r e x p r e s s i o n w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f e m p t y v e c t o r,a n d D A B a n d N B T s t a i n i n g s h o w e d d a r k e r c o l o r s.T h e q R T-P C R r e s u l t s o f N.b e n t h a m i a n a s h o w e d t h a t O f WR K Y120o v e r e x p r e s s i o n s i g n i f ic a n t l y r ed u ce d N b C A T e x p r e s s i o n,w h i l e s i g n if i c a n t l y i n c r e a s e d N b P5C S1,N b P5C S2a n d N b P5C R e x p r e s s i o n.ʌC o n c l u s i o nɔO f WR K Y120i n-c r e a s e d c o n t e n t s o f r e a c t i v e o x yg e n s p e c i e s(R O S)i n N.b e n th a mi a n a u n d e r s a l t s t r e s s a n d i m p r o v e d s e n s i-t i v i t y o f p l a n t s t o s a l t s t r e s s.K e y w o r d s:O s m a n t h u s f r a g r a n s;O f WR K Y120g e n e;s a l t s t r e s s;b r e e d i n g f o r s t r e s s t o l e r a n c e土壤盐碱化是限制植物生长与分布最主要的环境因素之一,易溶性盐分在土壤表层积累,达到胁迫程度时会造成植物氧化胁迫㊁离子失衡以及营养流失等一系列问题,进而损害植物的细胞㊁组织和器官,阻碍植物生长,从而导致植物生物量锐减㊂桂花(O s m a n t h u s f r a g r a n s)是四季常绿㊁集园林观赏与经济效益于一体的著名香花树种㊂我国盐碱化土地分布广泛,盐碱化土壤严重影响桂花的生长㊂目前桂花研究主要集中在花香[1-2]㊁花色[3-4]上,但有关调控盐胁迫分子机制的研究较少㊂WR K Y蛋白根据WR K Y结构域的数量和锌指结构的类型分为3组,其中具有2个WR K Y域的属于Ⅰ类,具有一个WR K Y域,且锌指结构C2-H2属于Ⅱ类,Ⅲ类WR K Y蛋白具有一个WR K Y域,锌指结构C2-H C[5]㊂目前已经在许多物种中发现了WR K Y转录因子家族[6-8],其成员通过调控渗透胁迫㊁活性氧系统等途径参与胁迫响应[9-11]㊂模式植物拟南芥中已经鉴定出74个WR K Y基因家族成员,这些基因参与调控多种非生物胁迫,其中A t-WR K Y25和A t WR K Y33双突变体对N a C l敏感,并且任何一方的过表达都赋予了植物对盐胁迫的耐受性[12]㊂盐胁迫下,过表达小麦T a WR K Y93能够通过加强渗透调节等途径来提高植物耐盐性[13]㊂来自棉花的G h WR K Y39基因则是参与多种信号通路调节活性氧系统,正向调控植物对盐胁迫的反应[14]㊂V v WR K Y30在调节活性氧清除和渗透物质积累中都发挥了作用,因此具有显著提高植物盐胁迫抗性的功能[15]㊂另外,WR K Y也可以激活下游与植物抗逆性相关的功能基因,从而间接参与植物盐胁迫调控,如在拟南芥中过表达Z mWR K Y33可以激活胁迫诱导基因R D29A表达,提高植物的耐盐性[16]㊂另外,一些WR K Y转录因子负调控植物耐盐性,增加植物对盐的敏感度㊂例如玉米Z m-WR K Y17作为一个负调控因子参与盐胁迫响应[17]㊂棉花G h WR K Y17通过增加植物细胞活性氧的产生来提高植物对盐胁迫的敏感性[18]㊂与野生型相比,C mWR K Y17转基因拟南芥中抗逆相关基因的相对表达量减少,表明菊花C mWR K Y17作为抑制因子参与植物对盐胁迫的响应[19]㊂虎茎蓼的WR K Y转录因子P c WR K Y33通过下调应激相关基因的诱导和增加细胞R O S水平,降低了转基因拟南芥的耐盐性[20]㊂现有的桂花耐盐研究大多集中于盐胁迫下不同桂花品种的生长与生理特性分析[21],也有研究发现O f G T3/42/46可以提高烟草的耐盐性[22]㊂桂花的O f S P L11基因通过促进生长和减少氧化损伤增强拟南芥对盐的耐受性[23]㊂但是目前对于桂花WR K Y基因在盐胁迫响应机制中的功能研究尚未见报道㊂本研究将桂花O f WR K Y120瞬时转化本氏烟草,分析其在盐胁迫下的功能,期望为桂花的抗逆育种提供潜在基因资源㊂1材料与方法1.1试验材料桂花材料为四季桂品种日香桂2年生扦插苗,盐处理采用含有250mm o l/L N a C l的1/2霍格兰氏营养液浸泡,对照(C K)为1/2霍格兰氏营养液浸泡,分别于处理后0,6,24,72h采样㊂本氏烟草(N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a)种子于南京林业大学风景园林学院分子实验室保存㊂亚细胞定位材料和瞬时转化材料均为30d苗龄的本氏烟草,生长条件为14h光/10h暗,光照强度150μm o l/(m2㊃s),温度541第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究23ħ,相对湿度60%~70%㊂p S u p e r1300表达载体㊁P19辅助载体和p-G B K T7载体,均由南京林业大学风景园林学院分子实验室保存;大肠杆菌T r e l i e f T M5α感受态细胞,购于擎科公司;根癌农杆菌菌株G V3101,购于唯地公司;R N A快速提取试剂盒,购于艾德莱公司;反转录试剂盒,购于全式金公司㊂过氧化氢测试盒和超氧阴离子测试盒,购于苏州科铭生物技术有限公司㊂1.2 O f WR K Y120生物信息学分析以课题组前期的日香桂转录组数据为基础,通过权重基因共表达网络分析,在与盐胁迫高度相关的模块中,根据基因表达量挑选出一个WR K Y候选基因,根据桂花WR K Y基因家族分析[1]的命名方法将其命名为O f WR K Y120㊂在N C B I网站(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/)中的b l a s t p 对O f WR K Y120氨基酸序列的同源蛋白进行检索,获得其他物种的W R K Y同源序列,将这些序列在D N A M A N中进行多重比对分析㊂从T A I R网站中获取拟南芥W R K Y基因家族成员的氨基酸序列,在M E G A10软件中构建进化树,进化树的构建采用邻接法(n e i g h b o r-j o i n i n g),b o o t s t r a p重复设置为1000㊂1.3O f WR K Y120的克隆与表达载体的构建剪取生长健壮的日香桂叶片,在液氮中研磨后用R N A快速提取试剂盒提取总R N A,然后按照反转录试剂盒的步骤进行反应㊂反应体系为2ˑT S 反应混合液10μL,O(D T)18引物1μL,g D N A酶1μL,混合酶1μL,总R N A7μL㊂反应程序为42ħ30m i n;85ħ5s㊂反应结束后得到c D N A,产物保存在-80ħ冰箱㊂从全基因组数据中获得桂花O f WR K Y120基因序列,O f WR K Y120基因全长克隆引物见表1㊂以日香桂叶片的c D N A作为模板进行P C R扩增,设置3个退火温度梯度(58,59,60ħ),经1.2%琼脂糖电泳检测后选择长度正确且亮度较高的目的条带切胶回收㊂用H i n dⅢ和S m aⅠ内切酶对p S u p e r1300表达载体双酶切使其线性化,将O f WR K Y120目的片段和载体的回收产物连接后转化大肠杆菌T r e l i e f T M5α感受态细胞,挑取单菌落进行P C R检测并送至斯普金公司测序,将测序正确的大肠杆菌提取质粒,然后利用冻融法转化农杆菌G V3101,P C R鉴定确保最终使用的农杆菌单菌落条带正确㊂未连接目的片段的p S u p e r1300空载体质粒转化农杆菌G V3101作为空载体对照㊂转化p S u p e r1300-O f WR K Y120和空载体的农杆菌菌液均保存于-80ħ冰箱㊂1.4农杆菌介导的瞬时遗传转化取200μL转入了p S u p e r1300-O f WR K Y120融合载体和空载体的农杆菌菌液,于20m L含k a n a 的液体L B培养基中振荡培养至菌液O D600为0.6~0.8,离心,倒去上层液体,保留菌体,加入助侵染液(150μm o l/L乙酰丁香酮,10mm o l/L吗啉乙磺酸,10mm o l/L M g C l2)重悬,调整O D值至0.6,目的基因和空载对照分别与p19辅助载体1ʒ1混合,室温避光静置3h,用1m L规格针管将上述菌液从叶片背面注射入本氏烟草㊂1.5 O f WR K Y120蛋白的亚细胞定位分析首先使用W o L F P S O R T预测O f WR K Y120蛋白的亚细胞定位,然后参照农杆菌介导的瞬时遗传转化法注射本氏烟草,瞬时转化后的本氏烟草暗培养10h,接着正常培养2d,D A P I室温避光条件下染色10m i n,清水漂洗2~3次后用纸巾吸干表面水分,使用激光共聚焦显微镜观察㊂1.6 O f WR K Y120蛋白的酵母自激活分析根据O f WR K Y120基因序列设计引物(表1),使用日香桂c D N A作为模板,构建p G B K T7-O f-WR K Y120重组质粒并转化至A H109酵母感受态细胞中,对照为未连接目的基因的p G B K T7载体质粒转化酵母㊂待含有重组载体和空载体的酵母长出后,选取菌检正确的单菌落稀释成5个梯度(100, 10-1,10-2,10-3,10-4),并点于S D/-T r p㊁S D/ -T r p-A d e和S D/-T r p-A d e+X-α-g a l缺素培养基上,30ħ倒置培养3~5d,观察并记录结果㊂1.7盐处理转O f WR K Y120基因烟草的染色及相关指标测定待本氏烟草生长30d,挑选长势一致的烟草植株,采用农杆菌介导的瞬时转化法,将含有p S u-p e r1300-O f WR K Y120重组质粒和空载体对照(E V)的菌液注射入烟草叶片,注射后暗培养8h,然后正常条件下生长2d后,用500mm o l/L盐水处理(浇灌植株),每盆浇水300m L,处理24h后采样,设置3组重复,每组4株植株㊂相对电导率测定取鲜样,其余样品液氮速冻后于-80ħ保存㊂过氧化氢(H2O2)含量和超氧阴离子(O-㊃2)含量测定分别采用过氧化氢测试盒和超氧阴离子测试盒㊂丙二醛(M D A)含量测定采用硫代巴比妥酸法[24],过氧化物酶(P O D)活性测定采用愈创木酚法[24],过氧化氢酶(C A T)活性测定采用紫外吸收法[24],脯氨酸含量和相对电导率测定参考文献[25]641西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷的方法㊂超氧化物㊁H 2O 2和M D A 染色分别用四唑氮蓝(N B T )㊁二氨基联苯胺(D A B )和S c h i f f 溶液进行目视检测[26]㊂选择500mm o l /L 盐处理24h 后的转基因植株相同部位的叶片,用N B T 和S c h i f f 溶液浸渍烟草叶片2h 或D A B 溶液浸渍本氏烟草叶片8h ,然后在90ħ无水乙醇中脱色30m i n㊂1.8 盐胁迫后本氏烟草的实时荧光定量分析以瞬时转化O f WR K Y120基因并经过盐胁迫处理后的本氏烟草叶片c D N A 稀释10倍后作为模板,对照为转p S u p e r 1300空载的本氏烟草c D N A ㊂O f WR K Y120在本氏烟草中瞬时过表达后,根据烟草中生理数据测定的结果,用q R T -P C R 检测抗逆相关的功能基因(N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2㊁N b P 5C R ㊁N b P O D 和N b C A T )是否被诱导表达,引物见表1,利用2-ΔΔC t阈值比较法计算基因的相对表达量㊂表1 本研究中的引物碱基序列T a b l e 1 B a s e s e q u e n c e s o f p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y引物用途P r i m e r a p pl i c a t i o n 引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e (5'ң3')O f WR K Y120基因的全长克隆F o r f u l l -l e n g t h c l o n i n g o f O f WR K Y120g e n e S 1300-FS 1300-RA A C G C T T T A C A G C A A G A A C G G A A T G T A G G T C A G G G T G G T C A C G A G G G TWR K Y 120-F c a a a t c g a c t c t a g a a a gc t t A T G G C T -G C T T C T T C A G G A A G T C WR K Y 120-Rt a t t t a a a t g t c g a c c c c g g g G C T C G A G A -G A G C A T A G A G T T T A T T G A 酵母转录自激活A u t o n o m o u s t r a n s c r i pt i o n a l a c t i v a t i o n T 7T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G 3B DT T T T C G T T T T A A A A C C T A A G A G T C A T 7-WR K Y 120-F a g g c c g a a t t c c c g g g g a t c c A T G G C T -G C T T C T T C A G G A A G T C T 7-WR K Y 120-Rg g t t a t g c t a g t t a t g c g g c c g c G C T C G A -G A G A G C A T A G A G T T T A T T G A R A N -FA G A A C C G A C A G G T G A A G G C A A 桂花中q R T -P C R 分析的基因G e n e s f o r q R T -P C R a n a l y s i s i n O .f r a gr a n s R A N -R T G G C A A G G T A C A G A A A G G G C T q WR K Y 120-F A C C C A A C A A T C A A C A T C A C C C q WR K Y 120-R T A A A C C A G G T G G A A T A G C G A A G N b a c t i n -F A T C C T C A C A G A G C G T G G T T A C N b a c t i n -R C A C T G A G C A C T A T G T T T C C G T N b P 5C S 1-F A T C T T G A T G G C A A G G C T T G T G C T G N b P 5C S 1-R A A G C T G A G C T G A G G T T A C G T C C A A N b P 5C S 2-F C C T G T T C T T G G T C A T G C T G A T G G T 烟草中q R T -P C R 分析的基因G e n e s f o r q R T -P C R a n a l ys i s i n N .b e n t h a m i a n a N b P 5C S 2-R G C A T T G C A G G C T G C T G G A T A A T C A N b P 5C R -F T G G A G A A G G C T G G A T T T C G T G G T A N b P 5C R -R T T C C G G C T G G T C C A C C A C T T A N b P O D -F A G G C T C A G G G G A C A A C A A C T N b P O D -R T C A C A A A A T C A G T G G C G A A A N b C A T -F C A C A G C C A C G C T A C T C A A G A C N b C A T -RC C A C C C A C C G A C G A A T A A A G1.9 数据分析表型统计㊁叶片化学染色和q R T -P C R 均进行3次生物学重复㊂桂花盐胁迫后O f WR K Y 120在叶片中的表达分析采用单因素方差分析,其他数据使用S P S S 24软件进行独立样本t 检验㊂用E x c e l 进行数据分析,A d o b e P h o t o s h o p CS 5软件用于绘图㊂2 结果与分析2.1 O f WR K Y 120生物信息学分析通过基因克隆获得O f WR K Y 120,其包含1个全长为1422b p 的完整开放阅读框,编码474个氨基酸㊂N C B I 分析结果(图1)显示,O f WR K Y 120具有2个保守结构域,属于Ⅰ型WR K Y 转录因子㊂通过N C B I 蛋白数据库搜索到与桂花O f WR K Y 120氨基酸序列相似的同源氨基酸分别来自欧洲油橄榄(O l e a e u r o p a e a v a r .s yl v e s t r i s ,X P _022863407.1)㊁泡桐(P a u l o w n i a f o r t u n e i ,K A I 3450269.1)㊁中果咖啡(C o f f e a c a n e ph o r a ,C D P 04081.1)㊁蓝果树(N ys s a s i n e n s i s ,K A A 8549473.1)㊁洋紫荆(B a u -h i n i a v a r i e ga t a ,K A I 4305373.1)㊁狭叶油茶(C a -m e l l i a l a n c e o l e o s a ,K A I 7984300.1)㊁中华猕猴桃(A c t i n i d i a c h i n e n s i s v a r .C h i n e n s i s ,P S S 09530.1)㊁夏威夷棉(G o s s y p i u m t o m e n t o s u m ,T Y H 81112.1)㊁君迁子(D i o s p yr o s l o t u s ,X P _052210128.1)和木豆(C a j a n u s c a ja n ,X P _020226257.1)㊂多序列比对结果(图2)表明,桂花O f WR K Y 120氨基酸与欧洲油橄榄WR K Y 氨基酸的相似性最高,为83.71%,而与木豆WR K Y 氨基酸的相似性最低,741第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究仅为61.2%㊂进一步构建系统发育树,结果(图3)显示,桂花O f WR K Y 120与欧洲油橄榄WR K Y 亲缘关系最近㊂图1 O f WR K Y 120保守结构域F i g.1 O f WR K Y 120c o n s e r v e d d o m a in X P _022863407.1.欧洲油橄榄;K A I 3450269.1.泡桐;C D P 04081.1.中果咖啡;K A A 8549473.1.蓝果树;K A I 4305373.1.洋紫荆;K A I 7984300.1.狭叶油茶;P S S 09530.1.中华猕猴桃;T Y H 81112.1.夏威夷棉;X P _052210128.1.君迁子;X P _020226257.1.木豆㊂深蓝色背景表示图上物种100%的氨基酸序列相同,粉色表示(100%,75%]氨基酸序列相同,浅蓝色表示(75%,50%]氨基酸序列相同,<50%氨基酸序列相同则不涂色㊂X P _022863407.1.O l e a e u r o p a e a v a r .s y l v e s t r i s ;K A I 3450269.1.P a u l o w n i a f o r t u n e ;C D P 04081.1.C o f f e a c a n e ph o r a ;K A A 8549473.1.N y s s a s i n e n s i s ;K A I 4305373.1.B a u h i n i a v a r i e ga t a ;K A I 7984300.1.C a m e l l i a l a n c e o l e o s a ;P S S 09530.1.A c t i n i d i a c h i n e n s i s v a r .C h i n e n s i s ;T Y H 81112.1.G o s s y p i u m t o m e n t o s u m ;X P _052210128.1.D i o s p y r o s l o t u s ;X P _020226257.1.C a j a n u s c a ja n .D a r kb l u e b ac k g r o u nd i n d i c a te s t h a t 100%of t h e s e q u e n c e s a r e i d e n t i c a l ,p i n k m e a n s t h a t (100%,75%]o f t h e s e qu e n c e s a r e t h e s a m e ,l i g h t b l u e m e a n s t h a t (75%,50%]o f t h e s e qu e n c e s a r e t h e s a m e ,a n d b e l o w 50%i t i s n o t c o l o r e d .图2 O f WR K Y 120与其他物种氨基酸序列比对结果F i g .2 A m i n o a c i d s e q u e n c e a l i g n m e n t b e t w e e n O f WR K Y 120a n d o t h e r s pe c i e s 841西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷将O f WR K Y120氨基酸序列与模式植物拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)的Ⅰ类WR K Y基因家族成员构建系统进化树,结果(图4)发现,O f-WR K Y120与拟南芥A t WR K Y25㊁A t WR K Y26㊁A t WR K Y33同源性较高,其中与A t WR K Y26最相近㊂图3 O f WR K Y120与其他物种WR K Y蛋白的系统进化树F i g.3 P h y l o g e n e t i c t r e e o f O f WR K Y120a n d WR K Y p r o t e i n s f r o m o t h e r s p e c i e sA t WR K Y s代表拟南芥Ⅰ类WR K Y氨基酸序列㊂A t WR K Y s r e p r e s e n t A r a b i d o p s i s c l a s s I WR K Y a m i n o a c i d s e q u e n c e s.图4 O f WR K Y120与拟南芥Ⅰ类WR K Y氨基酸序列的系统进化树F i g.4 P h y l o g e n e t i c t r e e o f O f WR K Y120a n d WR K Y c l a s sⅠs u b f a m i l y a m i n o a c i d s e q u e n c e o f A.t h a l i a n a2.2盐胁迫下O f WR K Y120基因在桂花叶片中的表达将日香桂2年生扦插苗在盐胁迫下处理0,6, 24,72h,检测O f WR K Y120基因在盐胁迫下的相对表达量,结果(图5)显示,盐胁迫处理72h后O f-WR K Y120的相对表达量显著高于其他处理时间及对照(C K),表明该基因在盐胁迫处理72h后被激活表达㊂2.3 O f WR K Y120蛋白的亚细胞定位和酵母自激活验证利用本氏烟草叶片对O f WR K Y120-G F P融合蛋白在细胞中的定位情况进行分析,在激光共聚焦显微镜下观察(图6A)发现,过表达O f WR K Y120的烟草细胞核有绿色荧光信号,并且与D A P I荧光染料的蓝色荧光信号基本重合,表明O f WR K Y120蛋白定位在细胞核上㊂图柱中不同小写字母表示不同处理时间之间以及与对照之间差异显著(P<0.05)㊂D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n d i f f e r e n t p r o c e s s i n g t i m e s a n d i n c o m p a r i s o n w i t h c o n t r o l(P<0.05).图5盐胁迫下O f W R K Y120基因在桂花叶片中的相对表达量F i g.5 E x p r e s s i o n O f W R K Y120i n O.f r a g r a n sa f t e r s a l t s t r e s s941第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究O f WR K Y 120酵母转录自激活结果(图6B )显示,O f WR K Y 120::pG B K T 7和阴性对照均能在S D /-T r p 缺陷型培养基上生长,但是在S D /-T r p-A d e 缺陷型培养基上均无法生长,并且两者都无法使X -α-ga l 变蓝㊂说明O f WR K Y 120无转录自激活活性㊂35S ::G F P 为空载对照,B D ::pG B K T 7为阴性对照㊂35S ::G F P e m p t y v e c t o r ,B D ::p G B K T 7n e ga t i v e c o n t r o l .图6 O f WR K Y 120蛋白亚细胞定位(比例尺=50μm )(A )和酵母转录自激活验证(B )结果F i g .6 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n (B a r =50μm )(A )a n d a u t o n o m o u s t r a n s c r i pt i o n a l a c t i v a t i o n (B )o f O f WR K Y 1202.4 转O f WR K Y120基因烟草的染色及相关生理指标表现由图7可以看出,瞬时转化O f WR K Y120的烟草植株可以表达桂花O f WR K Y 120基因,而转化空载体的植株未表达,瞬时转化烟草中均可以表达内参基因,证明O f WR K Y120成功地转入本氏烟草中㊂D A B ㊁N B T 和S c h i f f 化学染色通常用于分析植物中的过氧化氢㊁超氧阴离子和M D A 的变化[26]㊂由图8A 可以看出,D A B 和N B T 染色后,O f-WR K Y 120过表达转基因烟草叶片较对照都表现出更深的颜色,但是S c h i f f 染色后两者无明显差异㊂M.M a r k e r ㊂N b a c t i n 是本氏烟草的内参基因㊂M.M a r k e r .N b a c t i n i s a n i n t e r n a l r e f e r e n c e g e n e o f N .b e n t h a m i a n a .图7 空载体(L 1,L 2,L 3)和O f W R K Y120(L 4,L 5,L 6)瞬时转化本氏烟草的表达分析F i g .7 E x p r e s s i o n a n a l y s i s o f e m p t y v e c t o r (L 1,L 2,L 3)a n d O f W R K Y120(L 4,L 5,L 6)i n t r a n s i e n t l y tr a n s f o r m e d N .b e n t h a m i a n a 051西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷由图8B-D 可以看出,过表达O f WR K Y120烟草植株的过氧化氢㊁超氧阴离子和M D A 含量均较对照增加,并且超氧阴离子较对照差异极显著㊂说明相较于空载体对照,瞬时转化O f WR K Y 120的本氏烟草中积累了更多活性氧㊂A.D A B ㊁N B T 和S c h i f f 溶液对盐处理后本氏烟草叶片染色;B ㊁C 和D .本氏烟草中过氧化氢㊁超氧阴离子㊁丙二醛含量的测定㊂E V 表示瞬时转化空载体的本氏烟草,O f WR K Y 120表示瞬时转化桂花O f WR K Y 120基因的本氏烟草㊂**表示差异极显著㊂A.D A B ,N B T a n d S c h i f f s o l u t i o n s t a i n i n g o f N .b e n t h a m i a n a l e a v e s a f t e r s a l t t r e a t m e n t ;B ,C a n d D.D e t e r m i n a t i o n o f h y d r o ge n p e r o x i d e ,s u p e r o x i d e a n i o n a n d m a l o n d i a l d e h y d e c o n t e n t s i n N .b e n t h a m i a n a .E V (e m p t y v e c t o r )r e pr e s e n t s i n s t a n t a n e o u s t r a n s f o r m a t i o n o f p S u p e r 1300,O f WR K Y120r e p r e s e n t s N .b e n t h a m i a n a w i t h t r a n s i e n t t r a n s f o r m e d O .f r a g r a n s O fWR K Y 120g e n e .**i n d i c a t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e .图8 转基因烟草盐胁迫后的D A B ㊁N B T 和S c h i f f 染色以及相关生理指标表现F i g .8 D A B ,N B T a n d S c h i f f s t a i n i n g o f t r a n s ge n i c N .b e n t h a m i a n a af t e r s a l t s t r e s s a n d d e t e c t i o n o f r e l a t e d p h y s i o l o gi c a l i n d e x e s 由图9可以看出,与空载体对照相比,盐胁迫后O f WR K Y120过表达转基因植株的脯氨酸含量㊁P O D 活性和相对电导率均表现出上升趋势,其中脯氨酸含量和P O D 活性较对照差异显著或极显著,而C A T 活性呈现下降趋势,但差异不显著㊂2.5 O f WR K Y120在烟草中异源瞬时表达后的实时荧光定量分析从生理指标测定可以看出脯氨酸含量与过氧化物酶活性发生了显著变化,因此通过q R T -P C R 分析脯氨酸合成途径基因(N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2㊁N b P 5C R )㊁过氧化物酶基因(N b P O D )和过氧化氢酶基因(N b C A T )在瞬时过表达O f WR K Y 120和空载体对照烟草中的相对表达量,结果(图10)显示,过表达O f WR K Y120的烟草植株,N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2㊁N b P 5C R 和N b P O D 的相对表达量显著高于对照,而N b C A T 的相对表达量显著低于对照㊂151第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究*表示差异显著(P <0.05);**表示差异极显著(P <0.01)㊂下同㊂*i n d i c a t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05)a n d **i n d i c a t e s v e r y s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01).T h e s a m e b e l o w.图9 盐胁迫下瞬时转化O f W R K Y120和E V 株系的脯氨酸含量㊁相对电导率及P O D 和C A T 活性F i g .9 P r o l i n e c o n t e n t ,r e l a t i v e e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y ,P O D a c t i v i t y a n d C A T a c t i v i t y o f O f W R K Y120t r a n s ge n i c a n d E V p l a n t s af t e r s a l t t r e a t m e nt 图10 转基因烟草盐胁迫后的抗逆相关基因表达分析F i g .10 E x p r e s s i o n a n a l ys i s o f r e s i s t a n c e -r e l a t e d g e n e s i n t r a n s ge n i c t o b a c c o af t e r s a l t s t r e s s 3 讨 论WR K Y 转录因子参与多种信号途径,是植物许多生物学过程中的关键调控因子[27]㊂桂花中共鉴定出154个WR K Y 基因家族成员[1]㊂本研究的O f WR K Y120有2个WR K Y 保守结构域,属于Ⅰ型WR K Y 转录因子,与欧洲油橄榄同源性最高㊂对菊花的研究发现,WR K YⅠ类成员D g WR K Y 5在盐胁迫下表达上调,通过增强R O S 清除和诱导抗逆基因上调表达参与对盐胁迫的抵御[28]㊂拟南芥中与O f WR K Y120相似性最高的Ⅰ类WR K Y 基因A t WR K Y 25㊁A t WR K Y 26和A t WR K Y 33受低温和高盐的诱导[29],并且可以正向调节乙烯激活蛋白和热休克蛋白信号通路之间的合作,在植物耐热性中发挥协同作用[30]㊂本研究发现,桂花O f WR K Y120受到盐胁迫显著诱导,因此推测该基因在盐胁迫中发挥功能㊂本研究亚细胞定位的结果显示,O f -WR K Y 120定位于细胞核,酵母自激活结果表明O f WR K Y 120无自激活活性,说明该基因在细胞核内发挥作用,可能通过与其他基因互作来发挥功能㊂活性氧是植物体内的信号代谢分子,包括超氧阴离子和过氧化氢等,当活性氧过量时胞内稳态受到严重破坏,影响植物正常生长[31]㊂本研究中,D A B 和N B T 染色后,O f WR K Y120过表达转基因烟草叶片较空载体对照均表现出更深的颜色,同时超氧阴离子含量极显著高于对照,H 2O 2含量有升高趋势,说明O f WR K Y 120过表达转基因植株中活性氧含量较高㊂C A T 是植物体内有效清除R O S 的抗氧化酶,在植物应对非生物胁迫时起关键作用[32]㊂本研究中,盐胁迫后转基因烟草C A T 活性较对照降低,这可能导致过氧化氢清除效率下降造251西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷成活性氧的积累㊂有研究发现P O D含量与植物木质素合成有正相关关系,老化的组织中含有更多的P O D[33]㊂本研究发现,P O D活性较对照极显著升高,推测转基因植株在盐胁迫条件下加快了叶片变黄㊁老化进度,因此植物组织中合成更多P O D以应对逆境㊂脯氨酸一般被认为是植物细胞质内的渗透调节物质,在植物抗氧化方面起着积极作用,与未受胁迫的植物相比,胁迫下脯氨酸积累水平通常显著增加[34]㊂但是在盐胁迫下研究发现,高盐浓度长时间处理后,损伤更严重植株的脯氨酸含量更高[35],干旱研究中也有类似发现[36]㊂推测本研究中植物在遭遇严重胁迫时,O f WR K Y120过表达转基因植株较对照对盐胁迫更为敏感,受到更严重的胁迫危害,因此在组织中积累了更多的脯氨酸,其中具体机理还需要进一步研究㊂植物在盐胁迫时,转录因子会激活或抑制抗逆相关功能基因的表达,例如O s WR K Y54通过与O s-H K T1启动子W-b o x m o t i f区域结合对耐盐基因O s HK T1的表达进行调控,提高了水稻耐盐性[37]㊂O f G T3/42/46诱导R O S相关基因N b A P X表达增加,正向调控了烟草的耐盐性[22]㊂过表达C a C P1的转基因烟草在盐胁迫后耐盐能力减弱,并且抗盐相关基因N t NHX1和N t S O S1的表达量显著低于野生型[35]㊂本研究中,转基因植株的N b P5C S1㊁N b P5C S2㊁N b P5C R和N b P O D的相对表达量显著或极显著高于对照,而N b C A T的相对表达量显著低于对照,与相关生理指标的测定结果一致,说明过表达O f WR K Y120在基因水平对本氏烟草响应盐胁迫产生了调控作用㊂综上所述,桂花O f WR K Y120基因受到盐胁迫诱导,瞬时过表达该基因能够增加本氏烟草活性氧的积累,提高植物对盐胁迫的敏感性㊂[参考文献][1] D i n g W J,O u y a n g Q X,L i Y L,e t a l.G e n o m e-w i d e i n v e s t i g a-t i o n o f WR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n s w e e t o s m a n t h u s a n d t h e i r p o t e n t i a l r e g u l a t i o n o f a r o m a s y n t h e s i s[J].T r e e P h y s i o l-o g y,2020,40(4):557-572.[2]施婷婷,杨秀莲,王良桂.3个桂花品种花香组分动态特征及花被片结构解剖学观测[J].南京林业大学学报(自然科学版), 2020,44(4):12-20.S h i T T,Y a n g X L,W a n g L G.D y n a m i c c h a r a c t e r i s t i c s o f f l o-r a l f r a g r a n c e c o m p o n e n t s a n d a n a t o m i c a l o b s e r v a t i o n o f t e p a l s t r u c t u r e i n t h r e e o s m a n t h u s c u l t i v a r s[J].J o u r n a l o f N a n j i n gF o r e s t r y U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n),2020,44(4):12-20.[3] C h e n H G,Z e n g X L,Y a n g J,e t a l.W h o l e-g e n o m e r e s e q u e n c-i n g o f O s m a n t h u s f r a g r a n s p r o v i d e s i n s i g h t s i n t o f l o w e r c o l o re v o l u t i o n[J].H o r t i c u l t u r e R e s e a r c h,2021,8(1):98.[4] H a n Y J,C h e n W C,Y a n g F B,e t a l.c D N A-A F L P a n a l y s i s o n2O s m a n t h u s f r a g r a n s c u l t i v a r s w i t h d i f f e r e n t f l o w e r c o l o r a n d m o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o f O f M Y B1g e n e[J].T r e e s,2015, 29:931-940.[5] E u l g e m T,R u s h t o n P J,R o b a t z e k S,e t a l.T h e WR K Y s u p e r-f a m i l y o f p l a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s[J].T r e n d s i n P l a n t S c i-e n c e,2000,5(5):199-206.[6] X i e Z,Z h a n g Z L,Z o u X,e t a l.A n n o t a t i o n s a n d f u n c t i o n a l a n a-l y s e s o f t h e r i c e WR K Y g e n e s u p e r f a m i l y r e v e a l p o s i t i v e a n d n e g a t i v e r e g u l a t o r s o f a b s c i s i c a c i d s i g n a l i n g i n a l e u r o n e c e l l s [J].P l a n t P h y s i o l o g y,2005,137(1):176-189.[7] M u t h a m i l a r a s a n M,B o n t h a l a V S,K h a n d e l w a l R,e t a l.G l o b a la n a l y s i s o f WR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s u p e r f a m i l y i n S e t a r i ai d e n t i f i e s p o t e n t i a l c a n d i d a t e s i n v o l v e d i n a b i o t i c s t r e s s s i g n a-l i n g[J].F r o n t i e r s i n P l a n t S c i e n c e,2015,6:910.[8] D o n g J X,C h e n C H,C h e n Z X.E x p r e s s i o n p r o f i l e s o f t h e A r a-b i d o p s i s WR K Y g e n e s u p e r f a m i l y d u r i n g p l a n t d e f e n s e r e-s p o n s e[J].P l a n t M o l e c u l a r B i o l o g y,2003,51:21-37. [9] E u l g e n T,S o m s s i c h I E.N e t w o r k s o f WR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c-t o r s i n d e f e n s e s i g n a l i n g[J].C u r r e n t O p i n i o n i n P l a n t B i o l o g y, 2007,10(4):366-371.[10] L i a n g M H,J i a n g J G.A n a l y s i s o f c a r o t e n o g e n i c g e n e s p r o-m o t e r s a n d WR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n r e s p o n s e t o s a l t s t r e s s i n D u n a l i e l l a b a r d a w i l[J].S c i e n t i f i c r e p o r t s,2017,7(1):1-9.[11] Q i n Y,Y u H X,C h e n g S Y,e t a l.G e n o m e-w i d e a n a l y s i s o f t h eWR K Y g e n e f a m i l y i n M a l u s d o m e s t i c a a n d t h e r o l e o f M d-WR K Y70L i n r e s p o n s e t o d r o u g h t a n d s a l t s t r e s s e s[J].G e n e s,2022,13(6):1068.[12] J i a n g J,M a S,Y e N,e t a l.WR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i np l a n t r e s p o n s e s t o s t r e s s e s[J].J o u r n a l o f i n t e g r a t i v e p l a n t b i-o l o g y,2017,59(2):86-101.[13] Q i n Y X,T i a n Y C,L i u X Z.A w h e a t s a l i n i t y-i n d u c e d WR K Yt r a n s c r i p t i o n f a c t o r T a WR K Y93c o n f e r s m u l t i p l e a b i o t i c s t r e s s t o l e r a n c e i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J].B i o c h e m i c a l a n db i o p h y s ic a l r e s e a r c h c o mm u n i c a t i o n s,2015,464(2):428-433.[14] S h i W N,L i u D D,H a o L L,e t a l.G h WR K Y39,a m e m b e r o ft h e WR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y i n c o t t o n,h a s a p o s i t i v e r o l e i n d i s e a s e r e s i s t a n c e a n d s a l t s t r e s s t o l e r a n c e[J].P l a n tC e l l,T i s s u e a n d O r g a n C u l t u r e,2014,118(1):17-32.[15] Z h u D,H o u L X,X i a o P L,e t a l.V v WR K Y30,a g r a p e WR K Yt r a n s c r i p t i o n f a c t o r,p l a y s a p o s i t i v e r e g u l a t o r y r o l e u n d e r s a-l i n i t y s t r e s s[J].P l a n t s c i e n c e,2019,280:132-142. [16] L i H,G a o Y,X u H,e t a l.Z mWR K Y33,a WR K Y m a i z e t r a n-s c r i p t i o n f a c t o r c o n f e r r i n g e n h a n c e d s a l t s t r e s s t o l e r a n c e s i nA r a b i d o p s i s[J].P l a n t G r o w t h R e g u l a t i o n,2013,70(3):207-216.[17] C a i R H,D a i W,Z h a n g C S,e t a l.T h e m a i z e WR K Y t r a n-s c r i p t i o n f a c t o r Z mWR K Y17n e g a t i v e l y r e g u l a t e s s a l t s t r e s s351第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究t o l e r a n c e i n t r a n s g e n i c A r a b i d o p s i s p l a n t s[J].P l a n t a,2017, 246(6):1215-1231.[18] Y a n H R,J i a H H,C h e n X B,e t a l.T h e c o t t o n WR K Y t r a n-s c r i p t i o n f a c t o r G h WR K Y17f u n c t i o n s i n d r o u g h t a n d s a l t s t r e s s i n t r a n s g e n i c N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a t h r o u g h A B A s i g-n a l i n g a n d t h e m o d u l a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s p r o d u c-t i o n[J].P l a n t a n d C e l l P h y s i o l o g y,2014,55(12):2060-2076.[19] L i P L,S o n g A P,G a o C Y,e t a l.C h r y s a n t h e m u m WR K Yg e n e C mWR K Y17n e g a t i v e l y r e g u l a t e s s a l t s t r e s s t o l e r a n c e i nt r a n s g e n i c c h r y s a n t h e m u m a n d A r a b i d o p s i s p l a n t s[J].P l a n tC e l l R e p o r t s,2015,34(8):1365-1378.[20] B a o W Q,W a n g X W,C h e n M,e t a l.A WR K Y t r a n s c r i p t i o nf a c t o r,P c WR K Y33,f r o m P o l yg o n u m c u s p i d a t u m r e d u c e ss a l t t o l e r a n c e i n t r a n s g e n i c A r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J].P l a n tC e l l R e p o r t s,2018,37(7):1033-1048.[21]顾恒,李玲,欧阳绮霞,等.盐胁迫对3个桂花品种生长和生理特性的影响[J].中国野生植物资源,2020,39(10):28-34.G u H,L i L,O u y a n g Q X,e t a l.E f f e c t s o f s a l t s t r e s s o ng r o w t h a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h r e e o s m a n t h u sc u l t i v a r s[J].C h i n a W i ld P l a n t Re s o u r c e s,2020,39(10):28-34.[22] Z h u M L,B i n J,D i n g H Y,e t a l.I n s i g h t s i n t o t h e t r i h e l i x t r a n-s c r i p t i o n f a c t o r r e s p o n s e s t o s a l t a n d o t h e r s t r e s s e s i n O s m a n-t h u s f r a g r a n s[J].B M C g e n o m i c s,2022,23(1):1-18. [23] Z h u S K,F a n g Q,W a n g Y G,e t a l.O f S P L11g e n e f r o m o s-m a n t h u s f r a g r a n s p r o m o t e s p l a n t g r o w t h a n d o x i d a t i v e d a m-a g e r e d u c t i o n t o e n h a n c e s a l t t o l e r a n c e i n A r ab i d o p s i s[J].H o r t i c u l t u r a e,2022,8(5):412.[24]贺傲兵.酸枣对盐胁迫的生理响应及转录调控研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2022.H e A B.P h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e a n d t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o no f j u j u b e t o s a l t s t r e s s[D].Y a n g l i n g,S h a a n x i:N o r t h w e s tA&F U n i v e r s i t y,2022.[25]薛世伟.干旱胁迫对三种栀子生理特性的影响[D].长沙:中南林业科技大学,2022.X u e S W.E f f e c t s o f d r o u g h t s t r e s s o n p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r-i s t i c s o f t h r e e g a r d e n i a s[D].C h a n g s h a:C e n t r a l S o u t h U n i-v e r s i t y o f F o r e s t r y a n d T e c h n o l o g y,2022.[26] C h e n J,Z h o n g Y M,Z h a n g H Q,e t a l.N i t r a t e r e d u c t a s e-d e-p e n d e n t n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n i s i n v o l v e d i n m i c r o c y s t i n-L R-i n d u c e d o x i d a t i v e s t r e s s i n B r a s s i c a r a p a[J].W a t e r,A i r,&S o i l P o l l u t i o n,2012,223(7):4141-4152.[27] L i W X,P a n g S Y,L u Z G,e t a l.F u n c t i o n a n d m e c h a n i s m o fWR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e s o fp l a n t s[J].P l a n t s,2020,9(11):1515.[28] L i a n g Q Y,W u Y H,W a n g K,e t a l.C h r y s a n t h e m u m WR K Yg e n e D g WR K Y5e n h a n c e s t o l e r a n c e t o s a l t s t r e s s i n t r a n s g e n-i c c h r y s a n t h e m u m[J].S c i e n t i f i c R e p o r t s,2017,7(1):1-10.[29]付乾堂,余迪求.拟南芥A t WR K Y25㊁A t WR K Y26和A t-WR K Y33在非生物胁迫条件下的表达分析[J].遗传,2010, 32(8):848-856.F u Q T,Y u D Q.E x p r e s s i o n a n a l y s i s o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n aA t WR K Y25,A t WR K Y26a n d A t WR K Y33u n d e r a b i o t i cs t r e s s[J].H e r e d i t y,2010,32(8):848-856.[30] L i S J,F u Q T,C h e n L,e t a l.A r a b i d o p s i s t h a l i a n a W R K Y25,WR K Y26,a n d WR K Y33c o o r d i n a t e i n d u c t i o n o f p l a n t t h e r-m o t o l e r a n c e[J].P l a n t a,2011,233:1237-1252.[31] V a n B r e u s e g e m F,D a t J F.R e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s i n p l a n tc e l lde a t h[J].P l a n t p h y s i o l o g y,2006,141(2):384-390.[32] R a y P D,H u a n g B W,T s u j i Y.R e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s(R O S)h o m e o s t a s i s a n d r e d o x r e g u l a t i o n i n c e l l u l a r s i g n a l i n g[J].C e l l u l a r s i g n a l l i n g,2012,24(5):981-990.[33] T e r z i R,G u l e r N S,Ça l i s k a n N,e t a l.L i g n i f i c a t i o n r e s p o n s ef o r r o l l e d l e a v e s o f C t e n a n t h e s e t o s a u n d e r l o n g-t e r m d r o ugh ts t r e s s[J].T u r k i s h J o u r n a l o f B i o l o g y,2013,37(5):614-619.[34] T r o v a t o M,M a t t i o l i R,C o s t a n t i n o P.M u l t i p l e r o l e s o f p r o l i n ei n p l a n t s t r e s s t o l e r a n c e a n d d e v e l o p m e n t[J].R e n d i c o n t i L i n-c e i,2008,19:325-346.[35]杜清洁,周璐瑶,杨思震,等.过表达C a C P1提高转基因烟草对盐胁迫的敏感性[J].生物技术通报,2023,39(2):1-11.D u Q J,Z h o u L Y,Y a n g S Z,e t a l.O v e r e x p r e s s i o n o f C a C P1i m p r o v e s s e n s i t i v i t y o f t r a n s g e n i c t o b a c c o t o s a l t s t r e s s[J].B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n,2023,39(2):1-11.[36]邱见方.番茄转录因子P H Y T O C L O C K1(S l P C L1)基因的耐旱和耐寒功能研究[D].重庆:西南大学,2022.Q i u J F.S t u d y o n d r o u g h t t o l e r a n c e a n d c o l d t o l e r a n c e f u n c-t i o n o f t o m a t o t r a n s c r i p t i o n f a c t o r P H Y T O C L O C K1(S l P C L1)g e n e[D].C h o n g q i n g:S o u t h w e s t U n i v e r s i t y,2022.[37] H u a n g J J,L i u F H,C h a o D,e t a l.T h e WR K Y t r a n s c r i p t i o nf a c t o r O s WR K Y54i s i n v o l v e d i n s a l t t o l e r a n c e i n r i c e[J].I n-t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f M o l e c u l a r S c i e n c e s,2022,23(19): 11999.451西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷。
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS12048.1 v.A GENMED二氨基联苯胺（DAB）显色溶液产品说明书（中文版）主要用途GENMED二氨基联苯胺（DAB）显色溶液是一种旨在通过过氧化物酶的催化，而形成棕褐色不溶性产物，以鉴定过氧化物酶活性，进而确定目标印记的实验辅助试剂。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于辣根过氧化酶标记蛋白的免疫学检测包括蛋白质西方杂交和免疫化学，以及原位杂交染色等。
产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，显色清晰，重复性好。
技术背景二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物，且不受乙醇影响。
用于检测过氧化物酶的活性，灵敏度高，特异性好。
产品内容GENMED染色液（Reagent A）毫升GENMED反应液（Reagent B）毫升产品说明书1份保存方式保存GENMED染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，GENMED反应液（Reagent B）在4℃冰箱里；GENMED 染色液（Reagent A），避免光照，有效保证12月用户自备甲基绿复染试剂盒（GMS40010）或苏木素复染试剂盒（GMS80050）：用于常规染色后复染15毫升锥形离心管：用于显色工作液配制的容器平式摇荡仪：用于孵育和混匀反应1.5毫升离心管：用于配制染色工作液的容器光学显微镜：用于细胞染色后观察分析实验步骤一、 免疫印迹染色实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的GENMED染色液（Reagent A）和4℃冰箱里GENMED反应液（Reagent B）置入室温下，分别移出 毫升GENMED染色液（Reagent A）和 毫升GENMED 反应液（Reagent B）到15毫升锥形离心管，混匀后标记为GENMED显色工作液，避免光照。
