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建立基于SNaPshot技术的2_省略_CYP21A2突变的快速检测方法_刘英华

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·24·中国优生与遗传杂志 2014 年第 22 卷第 10 期

先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）属于一组因类固醇激素生物合成过程

中某种酶的先天性缺陷而引起的常见常染色体隐性遗传病，

在新生儿的发生率为1/5000[1]，不同类型CAH的临床表型

及生化表现基于缺陷酶的种类及残余酶活性的不同各有其

特点，其中21-羟化酶缺乏症是先天性肾上腺皮质增生症

中最常见的一种类型，约占90%-95%[2]，自19世纪中叶美

国科学家White等[3]对该基因进行克隆并报道了全部序列

以来，直到20世纪中叶荷尔蒙异常性状和隐性特征被确认

之后，许多先进国家在开展新生儿筛查的同时，还进行了

基因诊断和产前诊断方面的研究[4]。

分子水平检测的主要困难是21羟化酶真基因CYP21A2和假基因CYP21P具有高度的同源性，难于区

分。目前对CYP21A2基因突变主要检测方法包括Southern

杂交[5]、CYP21A2基因测序、多重连接依赖的探针扩增（MLPA）[6]、等位基因特异性聚合酶链反应（Allele-specific PCR，AS-PCR）、变性高效液相色谱（Denaturing high-

performance liquid chromatography，DHPLC）[7]等，由于

上述技术存在繁琐、高成本、低通量，或需要高质量的DNA等问题，临床应用难度较大，本研究旨在建立基于

中国人群CYP21A2常见的7个突变热点Exon3 Del 8bp、Q318X、R356W、IVS2 A/C>G、I172N、P30L和V281L的

SNaPshot筛查技术，并联合测序技术，以期建立一套方便

临床应用的标准化CYP21A2基因突变热点检测技术平台。

1　对象与方法

1.1　对象

5例常规新生儿遗传代谢性疾病筛查后高危并经临床

诊断为阳性的干血片标本（来源于苏州市新生儿疾病筛查

中心干血片库），女性4例，男性1例，其中4例失盐型，

1例单纯男性化型。

1.2　方法

1.2.1　基因组DNA制备　正常人对照取200μl外周血，

利用Qiagen公司的QIAamp® DNA Mini Kit提取基因组DNA，应用NanoDrop-1000（Thermo

公司）检测其浓度和基金项目：江苏省“十二五”科教兴卫工程医学重点人才资

助项目（RC2011036）

通讯作者：陈瑛建立基于SNaPshot技术的21-羟化酶

相关基因CYP21A2突变的快速检测方法

刘英华，李海波，王本敬，陈　瑛

（南京医科大学附属苏州医院 生殖与遗传中心，苏州　215002）

摘　要：目的　建立一种先天性肾上腺皮质增生症21-羟化酶缺陷的快速基因检测方法。方法　选择中国人群21-羟化

酶缺乏症相关基因CYP21A2的突变热点Exon3 Del 8bp、Q318X、R356W、IVS2 A/C>G、I172N、P30L和V281L共7个位点进行巢式PCR。设计上述突变热点的单链延伸引物进行扩增，采用SNaPshot技术对上述7个突变热点进行一次性基因分型检测。结果　建立了一套满足质量控制标准的CYP21A2基因快速检测的方法，5例阳性干血片标本患者SNaPshot技术和测序技术的结果完全吻合，有2例复合突变，3例纯合突变，显示SNaPshot技术高度的特异性和灵敏度。结论　采用SNaPshot技术检测CYP21A2基因具有高通量、准确、对样本容受性高的特点，便于临床应用。

关键词：肾上腺皮质增生症；SNaPshot技术；CYP21A2基因；测序技术

中图分类号：R586 文献标识码：A 文章编号：1006-9534（2014）10-0024-03

The establishment of the rapid detection method of 21-hydroxylase gene CYP21A2 mutations based Snapshot

technology. LIU Ying-hua1，LI Hai-bo1，WANG Ben-jing1，CHEN Ying1*. （Center for Reproduction and Genetics，Nanjing

Medical University Affiliated Suzhou Hospital，Suzhou 215002）

Abstract：Objective：To establish the method for rapid gene diagnosis of congenital adrenal hyperplasia（CAH）with

21-hydroxylase deficiency（21-OHD）. Methods：Nest amplification of Chinese population 21-hydroxylase deficiency the common mutation hot Exon3 Del 8bp，Q318X，R356W，the IVS2 A/C>G，I172N，P30L and V281L of seven sites were

performed using multiplex PCR technology. Afterwards，the sequence-specific probes interrogates each locus and labels it at the

3’ end using fluorescent dideoxynucleotide chemistry by the SNaPshot Multiplex Kit，the resulting products were then analyzed and genotyped in the presence of a fifth-dye-labeled size standard. Results：A rapid detection method of CYP21A2 gene set to

meet quality control standards was established，the results of Snapshot technology was consistent with the results of the sequencing

technology in five positive dried blood specimens. Two cases were complex mutation，three cases were homozygous mutation.

It is displayed a high degree of specificity and sensitivity of the Snapshot technology. Conclusion：The SNaPshot technology of

CYP21A2 gene detection had a high-throughput，accurate，and sample characteristics of high receptivity for clinical application.

Key words：Congenital adrenal hyperplasia；SNaPshot；CYP21A2 gene；Sequencing technologyDOI:10.13404/j.cnki.cjbhh.2014.10.008·25·中国优生与遗传杂志 2014 年第 22 卷第 10 期

纯度后，稀释至10 ng/μL。

5例阳性样本取2个直径为3.1mm的血斑，利用NP968型全自动核酸提取仪及其配套全基因组提取试剂盒

（西安天隆科技有限公司），按其标准操作流程抽取上述标

本基因组DNA，应用NanoDrop-1000（Thermo公司）检

测其浓度和纯度后，稀释至10 ng/μL备用。1.2.2　SNaPshot技术检测

（1）首先巢式PCR扩增 由于真基因CYP21A2和假基

因CYP21A1P具有高度的同源性，且真假基因可相互转换，

对CYP21A2基因检测采用巢式PCR

扩增，设计特异性扩

增引物P1F/R、P2F/R[8，9]扩增两个重叠的CYP21A2基因

片段，然后再用不同引物P3F/R、P4F/R、P5F/R

扩增待检

测的外显子及其侧翼序列以便于测序分析，扩增引物和延

伸引物均由上海捷瑞生物有限公司合成（已申请专利）。反

应体系为10 μL，含1.5 μL基因组DNA（10 ng/μL），1.5 μL dNTP（2 mmol/L），1.0 μL 10×PCR缓冲液，1.0 μL MgCl2溶液（25 mmol/L），0.75 U FastTaq酶（Roche公司），

0.8 μL无核酸酶的去离子水，各引物对的终浓度均为0.1 μmol/L。初级PCR采用的程序：95℃预变性5 min；95℃

变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环，

72℃，7 min，4℃保存，然后将将产物稀释10倍作为模板

进行次级PCR，程序：95℃预变性4 min；94℃ 变性30 s，

66℃退火59 s，每循环降0.5℃，72℃延伸59 s，11个循环；

94℃变性30 s，61℃退火50 s，72℃延伸50 s，24个循环；

72℃10 min，4℃保存，PCR反应在9700热循环仪（ABI

公司）中进行，产物于4℃保存。

（2）扩增产物的纯化，取1.5 μL扩增产物，加入2.0 U虾碱性磷酸酶（SAP酶，Fermentas公司），2.0 U Exon I

酶（Fermentas公司），去离子水2.1 μL，反应总体系为6 μL，混匀后37℃反应80 min，80℃终止反应15 min，4℃

保存。

（3）延伸标记、纯化，PCR反应体系为6.0 μL，含纯

化产物1.5 μL，5×Seq 缓冲液 1.2 μL，SNaPshot Multiplex Mix（ABI公司）1.0 μL，去离子水1.3 μL，7个位点

（Exon3Del8bp，Q318X，R356W，IVS2 A/C-G，I172N，P30L和V281L）的延伸引物终浓度为0.02-0.2 μmol/L。

PCR反应条件为：96℃预变性1 min；96℃变性10 s，52℃

退火5 s，60℃延伸30 s，28个循环，PCR反应在9700热

循环仪（ABI公司）中进行。反应结束后进行第2次纯化，

每反应产物中加入1 U SAP酶，37℃ 60 min，75℃灭活15 min，4℃保存。

（4）每反应体系中加入Hi-Di甲酰胺（ABI公司）9 μL，内标LIZ-120（ABI公司）0.2 μL，第二次纯化产物

1 μL，混匀离心后，95℃变性5 min，立即置冰上5 min，

然后于ABI公司3130遗传分析仪进行毛细管电泳，应用GeneMaper V3.0软件进行数据分析。

1.2.3　特异性扩增测序　根据真假基因序列的差别，对CYP21A2基因设计特异性扩增引物P1F/R、P2F/R[8，9]扩

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查询肿瘤突变基因的方法

查询肿瘤突变基因的方法

查询肿瘤突变基因的方法

肿瘤的发生与发展与基因突变密切相关。了解和查询肿瘤突变基因对于疾病的诊断、治疗及预防具有重要意义。本文将详细介绍几种查询肿瘤突变基因的方法。

一、肿瘤基因数据库查询

1.OncoKB：OncoKB是一个权威的肿瘤基因数据库，提供了丰富的肿瘤相关基因突变信息，包括基因变异、药物敏感性、临床研究等。用户可以通过基因名称、变异类型等关键词进行搜索。

2.COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）：COSMIC数据库收录了大量肿瘤体细胞突变信息，包括基因突变、基因表达、药物靶点等。用户可以通过基因名称、肿瘤类型等条件进行查询。

3.TCGA（The Cancer Genome Atlas）：TCGA是一个癌症基因组图谱项目，提供了多种癌症类型的基因突变数据。用户可以通过基因名称、癌症类型等关键词进行搜索。

二、生物信息学工具分析

1.MuPIT（Mutation Position Impact Tool）：MuPIT是一个在线生物信息学工具，可以分析基因突变对蛋白质结构的影响。通过输入基因名称和突变位置，可以查询到突变对蛋白质功能的影响程度。

2.SIFT（Sorting Intolerant From Tolerant）：SIFT是一个预测基因突变的生物信息学工具，通过分析氨基酸替换对蛋白质功能的影响，判断突变是否具有致病性。 3.PolyPhen-2（Polymorphism Phenotyping）：PolyPhen-2是一个预测单核苷酸多态性（SNP）对蛋白质功能影响的生物信息学工具，也可用于分析基因突变。

三、实验方法

1.PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应，是一种检测基因突变的方法。通过设计特异性引物，扩增目标基因片段，然后进行测序分析，可以检测到基因突变。

2.NGS（Next-Generation Sequencing）：下一代测序技术，是一种高通量、高灵敏度的基因检测方法。可以对肿瘤样本进行全基因组或目标基因测序，发现基因突变。

用PCR技术检测DNA样品中的基因突变

用PCR技术检测DNA样品中的基因突变

用PCR技术检测DNA样品中的基因突变

PCR（聚合酶链式反应）技术可以用于检测DNA样品中的基因突变，该技术是通过扩增DNA序列来检测其中的变异位点。以下是PCR技术检测DNA样品中的基因突变的步骤：

1. 根据要检测的基因，设计引物：设计两个特异性引物，这两个引物的序列应该都位于基因中的靶位点的上下游，并且应该没有其他类似的DNA序列。

2. DNA样品的提取：从细胞或组织中提取DNA样品。提取DNA的方法可以使用商业DNA提取试剂盒或自制方法，比如苛性钠/SDS法、碱裂解法等。

3. PCR反应：将DNA样品与引物、核苷酸、聚合酶和缓冲液混合，进行PCR反应。PCR反应包括一系列不同的温度循环，包括变性、退火和延伸步骤。在变性步骤中，DNA双链分离成两个单链。在退火步骤中，引物与目标DNA序列结合。在延伸步骤中，聚合酶使用核苷酸作为原料，以引物为模板合成DNA链。

4. 突变检测：PCR反应产生的DNA产物经过凝胶电泳分离，然后进行染色，目的是可视化PCR扩增的DNA片段。此外，可以使用各种技术，例如限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）和DNA测序来检测基因突变。

总之，PCR技术是一种快速、敏感和特异的检测DNA样品中基因突变的方法。这种技术可以应用于各种实验室和临床应用中，包括分子诊断、个性化治疗和基因工程等领域。

再写一个

RNA干扰（RNAi）技术在研究基因表达调控中的应用

RNA干扰技术是一种基于RNA分子间相互作用的生物技术，可以用于调节和研究基因表达。该技术通常利用siRNA（小干扰RNA）或shRNA（短发夹RNA）的能力来抑制基因转录和/或转录后的RNA分解。RNA干扰技术在研究基因表达调控方面有许多应用，以下是其中的一些：

1. 基因静默：RNA干扰技术可通过siRNA或shRNA，抑制目标基因的表达，从而研究该基因的生物学功能。研究者可以选择用合成siRNA、体外合成shRNA或者质粒载体介导shRNA的方式进行基因静默，从而研究靶向基因对于生物体生长发育、信号传导等过程的影响。

胚系突变检测方法

胚系突变检测方法

- 1 - 胚系突变检测方法

胚系突变检测方法是指对胚胎或胚胎干细胞进行基因突变检测的方法。胚胎或胚胎干细胞是人类或动物发育过程中最早的细胞，它们具有较强的自我复制和分化能力，因此被广泛应用于遗传学和生物医学研究中。

胚系突变检测方法包括基于PCR扩增、Sanger测序、SNP芯片、NGS测序等技术。其中，NGS测序是目前最常用的突变检测方法之一，它可以在单个细胞水平上进行高通量的基因组测序，对胚胎中的基因突变进行高效、准确的检测和分析。

胚系突变检测方法的应用范围非常广泛，包括基因组学研究、遗传疾病诊断、辅助生殖技术等领域。在生殖医学中，胚系突变检测方法可以帮助夫妻预防某些遗传性疾病的遗传风险，提高生育健康的成功率，具有重要的临床应用价值。

检测基因点突变的方法

检测基因点突变的方法

检测基因点突变的方法

检测基因点突变的方法有多种，常见的方法包括：

1. PCR扩增法：PCR是一种分子生物学技术，可用于扩增DNA片段。在检测基因点突变时，可根据已知的突变位点设计适当的引物，通过PCR扩增得到目标基因的片段，然后对扩增产物进行测序，以检测该位点是否发生了突变。

2. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量检测技术，可以同时检测上千个基因位点。在检测基因点突变时，将待检测样本中的DNA片段杂交到含有数千个不同基因探针的芯片上，经过染色体成像和数据分析，可以得出样本中每个位点的基因型。

3. NGS技术：全称为“下一代测序技术”，是一种高通量测序技术。NGS可以快速、准确地测序整个基因组或特定基因区域，从而检测基因点突变。

4. Sanger测序法：Sanger测序法是一种传统的测序技术，通过反复扩增、合成和分离DNA片段来确定DNA序列。在检测基因点突变时，可以使用Sanger测序法对目标基因的特定区域进行测序，从而检测该区域是否发生了突变。

总之，以上方法都有其优缺点，选择合适的方法需要考虑到样本数量、检测精度、成本等多个因素。