补肾活血化瘀方上调雄激素致不孕大鼠脂肪组织中胰岛素受体底物1及其酪氨酸磷酰化（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：李喜莲, 王针织, 俞超芹【摘要】研究雄激素致不孕大鼠（androgen sterilized rat, ASR）胰岛素受体底物1的表达及其酪氨酸磷酸化程度，探讨胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）的分子机制和补肾活血化瘀方的作用机制。
方法：ASR大鼠随机分为模型组、溶媒组（注射中性茶油）和补肾活血化瘀方组，各组均为15只大鼠。
观察大鼠体质量和胰岛素曲线下面积，并检测大鼠脂肪组织中胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1，IRS1）的表达及其酪氨酸磷酸化程度。
结果：模型组大鼠体质量和胰岛素曲线下面积高于溶媒组和补肾活血化瘀方组（P0.05）。
模型组脂肪组织中IRS1及其酪氨酸磷酸化程度低于溶媒组（P0.05），补肾活血化瘀方组IRS1的表达及其酪氨酸磷酸化程度上升，与模型组比较有统计学差异（P0.05）。
结论：补肾活血化瘀方能促进IR大鼠脂肪组织IRS1蛋白的表达及其酪氨酸磷酸化水平，这可能是其提高组织对胰岛素敏感性从而改善IR的机制之一。
【关键词】多囊卵巢综合征; 胰岛素抵抗; 胰岛素受体底物1; 酪氨酸; 磷酰化; 大鼠Objective: To investigate the expression of insulin receptor substrate1 (IRS1) and phosphorylation of tyrosine in androgen sterilized rats (ASRs) and the effects of Bushen Huoxue Huayu Recipe (BHHR), a compound Chinese herbal medicine for tonifying kidney and activating blood, on the ASRs, and to analyze the possible mechanism.Methods: ASR models were established by means of testosterone injected subcutaneously at the age of 9 days. The model rats were randomly divided into BHHR group (n=15) and untreated group (n=15); the rats in normal group (n=15) were injected with oil. The rats in the BHHR group were treated with BHHR for 30 days, and the rats in model group and normal group were treated with distilled water for 30 days.Body weight and area under the curve (AUC) of insulin were measured after treatment. Expression of IRS1 and phosphorylation of tyrosine in adipose tissue in ASRs were analysed by immunohistochemical method.Results: The body weight and insulin AUC in the untreated group were increased and more than those in the BHHR group and the normal control group (P0.05). Expression of IRS1 andphosphorylation of tyrosine in normal group were significantly higher than those in the untreated group (P0.05), and those in BHHR group were improved and significantly different from those in the untreated group (P0.05).Conclusion: BHHR can increase the expression of IRS1 and phosphorylation of tyrosine in adipose tissue in IR rats, which may be one of its mechanisms in improving insulin sensitivity of the target tissues.Keywords: polycystic ovary syndrome; insulin resistance; insulin receptor substrate1; tyrosine; phosphorylation; rats 多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS）是生育年龄妇女常见的内分泌疾病之一，临床上主要表现为闭经、月经稀发、不孕、多囊卵巢、高雄激素血症和持续不排卵，其发病机制不明。
近来研究发现，胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）在PCOS的发病中起重要作用［1］。
胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1, IRS1）作为胰岛素受体后信号重要转导分子之一，在PCOS合并IR 患者发病中起关键作用。
因PCOS发病原因复杂，临床表现多样化，目前尚无治疗该综合征的特效药。
中药补肾活血化瘀方（Bushen Huoxue Huayu Recipe, BHHR）为临床经验方，对PCOS有良好的疗效［2］。
王莉等［3］观察到雄激素致不孕大鼠（androgen sterilized rat，ASR）成年后具有高雄激素、高胰岛素、低促性腺激素、无排卵和多囊卵巢等表现，与PCOS有许多共同点。
本实验通过建立ASR 大鼠模型，检测大鼠脂肪组织中IRS1的表达及其酪氨酸磷酸化的程度，分析BHHR对ASR大鼠IRS1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化程度的影响，以期阐明其治疗PCOS的可能分子生物学作用机制。
1 材料与方法1.1 实验动物32只3月龄雌性成年SD大鼠和8只3月龄雄性成年SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（沪）20030003，由第二军医大学长海医院动物中心饲养。
合笼饲养［4］分娩8 d后选出雌性幼鼠105只用于实验。
1.2 药品和试剂丙酸睾酮注射液、中性茶油（上海通用药业股份有限公司，批号050503）；BHHR（当归15 g、赤芍10 g、白芍10 g、桑椹20 g、枸杞子20 g、瓦楞子15 g、制首乌18 g、麦冬12 g等）由第二军医大学长海医院中药房提供，自制成浓度相当于含生药2.56 g/ml的水溶液，制备方法见前期报道［4］；大鼠胰岛素试剂盒（美国LINCO Research）；兔抗鼠IRS1单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；兔抗鼠磷酸酪氨酸多克隆抗体（美国Thermo公司）；EnVision试剂盒（美国DaKo公司）；显色剂二氨基联苯胺（北京中山生物技术公司）。
1.3 ASR动物模型制备及分组模型建立方法同前期报道［4］，并予中性茶油注射作为溶媒对照组。
模型组中制模成功的30只大鼠进入后续实验，剔除60只仍有性周期的大鼠。
将成模的30只ASR随机分为BHHR组和模型组，每组15只。
溶媒对照组大鼠15只，70日龄后连续阴道脱落细胞涂片呈现动情周期。
各组大鼠在接受处理前体质量差异无统计学意义。
1.4 给药方式及剂量各组大鼠断奶后均喂以颗粒饲料，80日龄起，按动物与人体表比换算法换算相应剂量，BHHR组灌服BHHR 10 ml/(kg·d)；模型组及溶媒对照组每天灌服同容积蒸馏水。
每天早、晚各1次，连续30 d。
1.5 ASR大鼠胰岛素曲线下面积测定用药结束后参考大鼠性周期取材：有规律性周期的大鼠于110日龄后第一个动情前期取材；无规律性周期的大鼠于113日龄取材。
将大鼠称取体质量，当晚8点禁食，次日上午8点予50%葡萄糖溶液3 g/kg灌胃，在灌胃后0、0.5、1和2 h分别取眶静脉血，利用放射免疫法测定各时间点胰岛素水平。
药盒质量控制指标均符合要求，灵敏度0.1 ng/ml，批内和批间变异系数5.5％。
测定步骤严格按照说明书操作，计算大鼠血胰岛素曲线下面积（area under the curve, AUC）。
大鼠血胰岛素AUC＝1/4×空腹值＋3/4×60 min值＋1/2×120 min值。
1.6 各组大鼠IRS1及其酪氨酸磷酸化程度测定处死各组大鼠后，取腹膜下脂肪组织，4%多聚甲醛固定，制成石蜡切片，将标本置于58 ℃恒温干燥箱中烘烤24 h后，分别用兔抗鼠IRS1单克隆抗体、兔抗鼠磷酸酪氨酸多克隆抗体按EnVision 法进行免疫组化染色。
用PBS代替一抗作为阴性对照组，细胞质或（和）细胞膜呈现棕黄色颗粒反应者为阳性，无棕黄色颗粒反应者为阴性。
采用上海求为生物科技有限公司MIQAS医学图像定量分析系统、医学图像定量分析软件进行免疫组化染色结果分析，计算阳性区域面积、阳性比率和光密度值。
IRS1表达及其酪氨酸磷酸化均以免疫组化阳性指数表示。
免疫组化阳性指数＝阳性面积×光密度值/总面积。
每张切片分析3个视野，每组数据至少18个。
1.7 统计学方法采用SPSS 11.0软件进行统计分析。
计量资料数据用x±s表示，采用单因素方差分析（q检验），各组之间方差齐者用最小显著差异t 检验。
相关数据分别采用非参数符号等级检验（Wilcoxon检验）及非参数两样本等级秩和检验。
计数资料进行χ2检验。
2 结果2.1 各组大鼠体质量情况模型组大鼠体质量高于溶媒对照组（P0.05）；BHHR组大鼠体质量与模型组比较，差异有统计学意义（P0.05）。
见表1。
表1 3组大鼠体质量和血胰岛素曲线下面积（略）2.2 各组大鼠胰岛素曲线下面积模型组大鼠血胰岛素曲线下面积大于溶媒对照组（P0.05）；BHHR组血胰岛素曲线下面积与模型组比较，差异有统计学意义（P0.05）。
