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IP-10重组腺病毒载体的构建及其病毒制备邵紫韫;刘志锋;彭毅;徐佳;邓鹏;姜勇【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2006(26)11【摘要】目的利用细菌内同源重组法构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的γ-干扰素诱导蛋白10(IP-10)重组腺病毒载体并制备重组腺病毒.方法将IP-10编码序列克隆入带有EGFP示踪的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-CMV/IP-10,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd/IP-10;酶切鉴定正确后转染HEK293细胞.收集病毒上清,PCR鉴定正确后,扩增并再次感染HEK293细胞检测病毒感染能力.结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在HEK293细胞中包装成有感染活性的病毒颗粒.结论成功地构建了表达IP-10蛋白的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒Ad/IP-10,为研究IP-10的蛋白功能提供了一个重要工具.【总页数】4页(P1552-1555)【作者】邵紫韫;刘志锋;彭毅;徐佳;邓鹏;姜勇【作者单位】南方医科大学基础医学院广东省功能蛋白质组学重点实验室,广东,广州,510515;南方医科大学基础医学院广东省功能蛋白质组学重点实验室,广东,广州,510515;南方医科大学基础医学院广东省功能蛋白质组学重点实验室,广东,广州,510515;南方医科大学基础医学院广东省功能蛋白质组学重点实验室,广东,广州,510515;南方医科大学基础医学院广东省功能蛋白质组学重点实验室,广东,广州,510515;南方医科大学基础医学院广东省功能蛋白质组学重点实验室,广东,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒 [J], 罗栩伟;刘康;陈竹;赵明;韩小伟;白亦光;冯刚2.应用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165重组腺病毒 [J], 高全文;宋慧锋;柴家科;柳春明3.以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体[J], 齐桓4.应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒 [J], 徐爱晶;李堂5.应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒 [J], 罗小辑;金先庆;陈瑾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
２０１０年２月第２３卷第２期Ｊ Ｍｅｄ Ｐｏｓｔｇｒａ，Ｖｏ１．２３，Ｎ ． ， ！ ・１１７・ 论 著 （基础研究）
人ＳＥＴ基因小分子干扰ＲＮＡ重组腺病毒载体的 构建与鉴定
许波群，李 瑛，薛 凯，李 梅，马 翔，刁飞扬，崔毓桂，刘嘉茵 ［摘要］ 目的ＳＥＴ基因表达产物是ＳＥＴ／ＴＡＦ．１ｐ蛋白，功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程， 多水平、多通路地调节靶因子，其表达异常与多种疾病相关。为研究ＳＥＴ基因与临床多种疾病发生发展的关系，文中构建表 达人ＳＥＴ基因的小分子干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）重组腺病毒载体。 方法根据ｓｉＲＮＡ靶序列设计并合成２条互补的６４ ｂｐ寡核 苷酸。ｐｓｈｕｔｔｌｅ．Ｈｌ穿梭质粒经 Ⅱ、Ｈｉｎｄｍ双酶切后，与退火的寡核苷酸连接，构建穿梭质粒ｐＳｈｕｔｔｌｅ・Ｈ１一ｓｉＲＮＡ。该穿梭质 粒经Ｎｏｔ Ｉ和Ｈｉｎｄ１１１双酶切后与ｐＡｄＴｒａｃｋ．ＣＭＶ连接，构建含有绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）报告基因的穿 梭质粒ＰＡＴＣ—Ｈ１一ｓｉＲＮＡ。分别将腺病毒骨架质粒ｐＡｄＥａｓｙ一１和穿梭质粒ＰＡＴＣ—Ｈ１一ｓｉＲＮＡ转化至ＢＪ－５１８３感受态细菌中进行 同源重组。Ｐａｃ Ｉ酶切线性化重组质粒ｐＡｄ—Ｈ１．ｓｉＲＮＡ后，转染ＡＤ２９３细胞进行病毒包装和扩增。根据ＧＦＰ报告基因的表达 观察重组病毒的产生和感染效率，用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测人ＳＥＴ蛋白的表达水平。 结果穿梭质粒ｐＳｈｕｔｔｌｅ・Ｈ１一ｓｉＲＮＡ经双酶 切和测序证实构建成功；重组腺病毒载体经ＡＤ２９３细胞包装后可观察到ＧＦＰ表达；获得的重组腺病毒载体感染ＡＤ２９３细胞。 经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测，ＳＥＴ基因腺病毒载体（ＡｄＨ１一ＳｉＲＮＡ／ＳＥＴ）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒 载体组（ＡｄＨ１一ＳｉＲＮＡ／ＮＳ）相比，ＳＥＴ蛋白表达水平显著降低（Ｐ＜０．０５），抑制效率为５０％～７０％。 结论成功构建了表达 人ＳＥＴ基因的ｓｉＲＮＡ重组腺病毒载体ＡｄＨ１一ｓｉＲＮＡ／ＳＥＴ，并在ＡＤ２９３细胞中验证其抑制ＳＥＴ蛋白表达的作用，为进一步研究 ＳＥＴ基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。 【关键词】ＳＥＴ基因；ＲＮＡ干扰；重组腺病毒载体 ［中图分类号］ Ｑ７８４ ［文献标志码】 Ａ ［文章编号】 １００８—８１９９（２０１０）０２－０１１７－０６
小鼠NR4A1基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定薛凯;李梅;刁飞扬;凌静;崔毓桂;刘嘉茵【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2009(22)2【摘要】目的:构建表达小鼠NR4A1基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体. 方法:根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸.pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸进行连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA.PmeⅠ酶切pShuttle-H1-siRNA, 然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组.PacⅠ酶切线性化重组质粒pAdEasy-H1-siRNA后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增.Western blot检测NR4A1基因的表达. 结果:穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功,进一步构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体,重组腺病毒AdH1-siRNA/NR4A1感染小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)后显著抑制目的蛋白表达(抑制率为70%～90%). 结论:成功构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA/NR4A1,并在MLTC-1中验证其抑制NR4A1蛋白表达,为进一步研究NR4A1基因在多囊卵巢综合征(PCOS)中的作用奠定了基础.【总页数】6页(P115-119,后插1)【作者】薛凯;李梅;刁飞扬;凌静;崔毓桂;刘嘉茵【作者单位】南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心,江苏南京,210029;南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心,江苏南京,210029;南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心,江苏南京,210029;南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心,江苏南京,210029;南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心,江苏南京,210029;南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心,江苏南京,210029【正文语种】中文【中图分类】R784【相关文献】1.小鼠Hsp27基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 刘金娟;崔毓桂;马翔;刘嘉茵2.小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 夏迪;钱倩;刘志成;谭鸣鸣;丁媛;苏欣;孙文逵;施毅3.人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 许波群;李瑛;薛凯;李梅;马翔;刁飞扬;崔毓桂;刘嘉茵4.小鼠Calb_2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 王菁;罗建;刘珊;代晓南;高莉;高超;刘嘉茵;崔毓桂5.小鼠CD200基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王琼;陈冬梅;王立斌;魏军;李玉奎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HBsAg重组腺病毒载体的构建、鉴定
周智;姚集鲁;杨林;邓练贤;陈雪娟
【期刊名称】《中山大学学报：医学科学版》
【年(卷),期】2000(0)S1
【摘要】:【目的】为探索腺病毒载体在基因治疗中的应用及其表达目的抗原的有效性。
【方法】用BamHⅠ、EcoRⅠ双切质粒 pBluscriptKS+ HBs ,回收S基因片段 ,定向克隆插入质粒 pACCMVpL中相应的酶切位点 ,通过快速抽提酶切鉴定筛选重组质粒。
【结果】挑取的 8个克隆经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定 ,有 95 0bp的目的基因片段 ,证明为重组体。
【结论】成功构建表达HBsAg基因的重组腺病毒载体。
【总页数】2页(P72-73)
【关键词】病毒性肝炎,乙型;腺病毒载体;DNA重组
【作者】周智;姚集鲁;杨林;邓练贤;陈雪娟
【作者单位】中山医科大学附属第三院传染病科实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R373
【相关文献】
1.HBsAg重组腺病毒载体的构建及在树突状细胞的表达 [J], 黄茵;陈智;贾红宇;蔡玲斐
2.钙网蛋白融合HBsAg基因重组腺病毒新型载体疫苗的构建与鉴定 [J], 张兰春;
王宝红;王芳;马春玲
3.HBsAg重组腺病毒载体的构建，鉴定 [J], 周智;姚集鲁;杨林
4.HBsAg基因克隆构建重组腺病毒载体pAdCMV/HBs [J], 王海燕;张学庸;何凤田;刘志国
5.抑制miR-327表达的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 郑涛;杨简;刘晓雯;杨英;李奇;杨俊;
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腺相关病毒载体pAGX(+)的构建史耕先;刘音;赵方萄;朱立平【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2001(021)005【摘要】目的构建腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定,以介导真核细胞的基因传递和表达. 方法以基因重组技术构建AAV载体,用Southern杂交、狭缝杂交以及激光共聚焦显微镜等鉴定构建的AAV载体. 结果成功地获得了重组AAV表达载体pAGX(+),藉报告基因EYFP鉴定pAGX(+),见pAEYFP经包装的重组AAV储存液的感染滴度达1.39×107 TU(transmission unit)/ml、复制滴度达1.94×1011颗粒/ml.Southern杂交表明EYFP基因获得成功拯救.rAAV/EYFP颗粒成功转导COS 7细胞,EYFP获得表达,并整合入COS 7细胞基因组,而藉质粒载体pEYFPCMV介导的转移,EYFP未能整合. 结论成功地构建了一个AAV载体,并成功地介导了基因的转移、表达和整合.【总页数】5页(P547-551)【作者】史耕先;刘音;赵方萄;朱立平【作者单位】中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫学系,;中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫学系,;中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫学系,;中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫学系,【正文语种】中文【中图分类】R37【相关文献】1.抑制miR-140腺相关病毒载体的构建及鉴定2.携带 CIP2A shRNA 重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定3.携带NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其评价4.低氧启动腺相关病毒载体的构建及高感染滴度质粒辅助重组腺相关病毒的获取5.人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910116197.8(22)申请日 2019.02.15(71)申请人 北京门罗生物科技有限公司地址 102206 北京市昌平区能源东路1号，奇点中心A座608室(72)发明人 芦志华 朱滨 董明洁 (74)专利代理机构 北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11690代理人 张丹 徐丹丹(51)Int.Cl.C12N 15/864(2006.01)C12N 7/00(2006.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01)(54)发明名称一种用于通用型CAR-T制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种生理性通用型CAR -T制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用，所述重组腺相关病毒载体能够用于CAR基因的表达，CAR -T细胞的制备。
本发明还涉及所述载体、CAR -T细胞的在抗肿瘤方面的应用。
权利要求书1页 说明书9页序列表14页 附图5页CN 109825526 A 2019.05.31C N 109825526A权 利 要 求 书1/1页CN 109825526 A1.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列、3’末端反向重复序列以及编码CAR基因的序列。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述编码CAR基因的序列为CD19CAR(4-1BB)。
3.如权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体进一步包含如下操作性连接的序列元件：SA序列、2A序列、polyA序列、5’基因组同源序列(5’HA)、3’基因组同源序列(3’HA)。
4.如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQ ID NO:4所示的序列。
小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建及制备陈吉泉;修清玉;刘涛;何皓頔;颜泽敏【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2007(23)1【摘要】目的构建小鼠T-bet基因重组腺病毒。
方法采用RT-PCR方法从小鼠脾脏活化的T淋巴细胞中扩增的cD-NA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒,酶切线性化后,与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-l以电穿孔的方法共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经酶切鉴定筛选正确重组子,以线性化重组质粒转染293细胞,制备重组腺病毒小鼠T-bet重组腺病毒AdT-bet,最后以PCR及Western blot方法鉴定T-bet的表达。
结果感受态大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组24h后共获得35%阳性重组质粒克隆,经酶切获得一个30kb的大片段和一个4.5kb的小片断。
该质粒转染293细胞后获得的重组腺病毒可高效表达T-bet,纯化后病毒滴度为2.0×1011PFU/mL。
结论应用细菌内同源重组法成功快捷构建了含小鼠T-bet基因的重组腺病毒,所获得的AdT-bet可进一步应用支气管哮喘等疾病的基因治疗研究。
【总页数】4页(P84-87)【关键词】T-bet;AdEasy系统;基因治疗;腺病毒载体【作者】陈吉泉;修清玉;刘涛;何皓頔;颜泽敏【作者单位】第二军医大学长征医院呼吸内科【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.小鼠FAM3C基因重组腺病毒载体的构建及其在肾系膜细胞中的表达 [J], 樊守艳;王杨;张晓燕;韦祎;王继浩;2.以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体[J], 齐桓3.小鼠SPINK5基因重组过表达腺病毒载体构建及其对特应性皮炎小鼠模型皮损疗效的研究 [J], 狄正鸿;许静;侯殿东;纪莲;刘晓梅;孙鲁宁4.小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建 [J], 檀卫平;黄嘉凌;刘然义;梁志慧;黄必军;麦贤弟;黄绍良;黄文林5.小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 夏迪;钱倩;刘志成;谭鸣鸣;丁媛;苏欣;孙文逵;施毅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
网络出版时间：2012-04-28 15:36网络出版地址：/kcms/detail/61.1399.R.20120428.1536.001.html携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建何娟娟1，马列婷2，王亚文2，惠凌云2，杨广笑3，王全颖3（1.西安交通大学医学院临床检验诊断专业，陕西西安710061；2.西安交通大学第一医院检验科，陕西西安710061；3.西安华广生物工程有限公司，陕西西安710025）摘要：目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒，为探讨AcSDKP（乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸）的多样化功能提供基础。
方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板，PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段，插入腺相关病毒载体穿梭质粒PSSHG-CMV，构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。
用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒，三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞，包装rAAV-NT4-AcSDKP，RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。
结果成功合成NT4-AcSDKP基因，构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，包装获得滴度为3.40×1010copies/ml的重组腺相关病毒。
结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒，为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。
关键词：NT4-AcSDKP；PCR技术；重组腺相关病毒中图分类号：文献标志码：A 文章编号：1671-8259Construction of NT4-AcSDKP recombinant adeno-associated virusHE Juan-juan1, MA Lie-ting2, WANG Ya-wen2, HUI Ling-yun2,YANG Guang-xiao3, WANG Quan-ying3(1. Specialty of Clinical Diagnosis, Medical School of Xi’an Jiaotong University,Xi’an, 710061; 2. Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 3. Xi’AN HuaguangBiological Engineering Co. Ltd., Xi’ an, 710025, China)ABSTRACT: Objective To construct and produce the NT4-AcSDKP recombinantadeno-associated virus (AAV) and determinate the titer. Methods With plasmid收稿日期：2011-12-15 修回日期：2012-03-10通讯作者：马列婷，主任技师. E-mail: mltmed@作者简介：何娟娟（1985-），女（汉族），硕士研究生. E-mail: he88531250@vector pGEM-T Easy/NT4 as the template, NT4-AcSDK was obtained by polymerase chain reaction (PCR) and inserted into vector plasmid PSSHG-CMV to construct the recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKP. The recombinant AAV-NT4-AcSDKP was packaged through co-transfecting 80% of confluent 293 cells with adenovirus full genome plasmid pFG140, helper plasmid pAAV/Ad and the recombinant plasmid. The recombinant AAV-NT4-AcSDKP was titrated by RT-PCR. Results The gene of NT4-AcSDKP was synthesized and the recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKP was constructed successfully. RT-PCR results showed that we had obtained the rAAV of high titer (3.40×1010copies/ml). Conclusion We have successfully obtained the AcSDKP-expressing rAAV and paved the way for further studies on anti-inflammation, anti- fibrosis, and organ repair.KEY WORDS: NT4-AcSDKP; polymerase chain reaction (PCR) technique; recombinant adeno-associated virus (rAAV)近年来，由于AcSDKP（乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸）在人体内广泛存在且生物功能多样化引起科学工作者的广泛关注，经大量研究证实四肽AcSDKP可以抑制造血干/祖细胞增殖，对人骨髓间充质干细胞也有抑制作用，在放化疗期间起到保护剂的作用[1]；促进血管发生、抗炎症、促进生殖系统发育等，而且对肾脏[2]、心脏[2-3]、肝脏[4]、肺[5]等器官损伤引起的纤维化也具有抑制作用，因此其成为研究热点，对多种临床疾病治疗具有巨大潜力。
然而AcSDKP 获得途径受限，目前几乎都是商品化合成，价格昂贵，因此本文应用PCR技术、T-载体克隆法和病毒包装技术，构建并包装表达目的蛋白AcSDKP的重组腺相关病毒，为深入开展AcSDKP在治疗炎症、器官纤维化等疾病方面的研究奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料质粒载体pGEM-T Easy/NT4，由张华博士构建赠送；克隆载体pGEM-T质粒购自Promega公司；限制性内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等试剂购自华美生物工程公司；辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒全基因组质粒pFG140、腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV、293细胞系、大肠杆菌TOP10、E. coli DH5α菌株及试验设备等均由西安华广生物工程公司提供。
1.2 目的基因NT4-AcSDKP的PCR扩增根据Genbank提供的MSDKP基因序列和已有的pGEM-T Easy/NT4载体模板，使用负链延伸原理，设计正、反向引物，正向引物加入保护碱基和Eco RⅠ酶切位点（G↓AA TTC），反向引物加入保护碱基、终止子和Bam HⅠ酶切位点（G↓GA TCC），并使负向引物中3′端有20个碱基与模板互补，应用DNASIS计算机软件设计下列引物，引物为BioAsia94℃变性5min72℃再延伸的基因TOP10含Amp酶Eco1.3 质粒合酶切10g/L基因片段，连接产物转化感受态细菌E.coli DH5α，碱裂解法小提质粒用Eco RⅠ和Bam HⅠ联合酶切，筛选出重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，然后碱裂解法大量提取重组阳性质粒（图1）。
重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP构建过程示意图1.4 、1.5 液中，1.6量60s，54℃2 结果2.1 cDNA克隆及鉴定以pGEM-T Easy/NT4载体为模板进行PCR，所得产物和DNA marker参照物相对比，琼脂糖凝胶电泳获得约270bp的NT4-AcSDKP 基因片段，该值与理论值相符(图2)。
构建的克隆载体质粒命名为pGEM-T /NT4-AcSDKP，大小约为3270bp。
经Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果可见约270bp的目的片段，与理论值相符，显示阳性重组质粒被完全切开，说明NT4-AcSDKP成功重组于pGEM-T内(图3)，并且在测序的回报结果中找到NT4-AcSDKP融合基因序列，应用DNASIS软件分析，显示测序结果与我们设计的融合基因序列完全一致。
a b270bp图2 产物电泳图Fig.2 Identification of PCR product of NT4-AcSDKP cDNAa：PCRa b c图3 pGEM-T /NT4-AcSDKP酶切电泳鉴定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmidac：2.2 ，转化感受态细菌E.coli DH5α菌株，提重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，Eco R I和Bam HⅠ联合酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳，分别得到约为270bp与5202bp两基因片段，与理论值相符(图4)。
a b c图4 pSSCMV-NT4-AcSDKP酶切鉴定电泳图谱Fig.4 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKPa：重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP；b：重组质粒经E co RⅠ、B am HⅠ酶切；c：DNA Marker。
2.3 重组腺相关病毒的包装与滴度测定结果将成功构建的pSSCMV-NT4-AcSDKP、包装质粒pAAV/Ad和腺病毒全基因组质粒pFG140，采用三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞，包装得到重组腺相关病毒。
利用RT-PCR法测定滴度为3.40×1010 copies/ml。
3 讨论AcSDKP是胸腺素β4（Tβ4）的氨基端四肽，其氨基端含有POP（脯氨酰寡肽酶）裂解位点，经此酶裂解可获得四肽AcSDKP。
根据等电点的不同，胸腺素分为a、β、γ三类。
β族胸腺素等电点为5.0～7.0，其结构高度保守，由40～44个氨基酸组成，目前已发现的β族胸腺素有15种，其中Tβ4是在人体内分布最广泛、含量最多的，具有多种功能，如抗炎症[6]、修复损伤组织[7]等。
作为Tβ4的氨基端肽，AcSDKP具有同样的生物功能，如通过抑制造血干/祖细胞、骨髓间充质干细胞的增殖，在癌症病人治疗期间发挥保护骨髓造血功能的作用；促进血管发生、抗炎等，另外其对各种损伤因素引起肾脏[2]、心脏[2-3]、肝脏[4]的纤维化也具有抑制作用。
