1 / 6 血红蛋白的凝胶过滤 植物098 原硕 0901080808 摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。 关键字：血红蛋白，凝胶过滤 一、 研究背景及目的： 凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果等优点。在很多方面都有所应用： ⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。 ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力， 2 / 6 可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。 ⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。 ⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液 所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。 二、 研究依据及原理： 凝胶过滤是一种按照分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的 3 / 6 层析柱中，用缓冲液洗脱，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 凝胶过滤还可以根据需要用某种试剂很方便的处理某种物质，当该物质流经试剂区时，因为可连续接触新鲜试剂，因而可以充分发生反应，最后经过洗脱，在与过量的试剂分开，本实验中，就是通过凝胶过滤，用还原剂FeSO4处理血红蛋白，在层析柱中加入含有还原剂的溶液，使形成一个还原区带，当血红蛋白样品（血红蛋白与铁氰化钾的混合液）流经还原区带时，褐色的高铁血红蛋白立即生成紫色的还原型血红蛋白，还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧分子结合形成鲜红色的氧合血红蛋白，铁氰化钾则因分子量小，呈黄色带落在后面。 三、 实验材料与方法： 1、 仪器：层析柱 Hl-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂） 玻璃棒 滤纸 烧杯 2、 试剂： （1）20mM磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠） 4 / 6 （2）还原层试剂（1:1的40mMFeSO4和80mMNa2H2EDTA,0.2MNa2HPO4） （3）Sephadex G-25 （4）血红蛋白样品 取1ml抗凝血于烧杯中，假如10ml pH7，20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，使浓度达5mg/ml，备用 3、 实验方法： 1） 装柱及平衡：取下层析柱上端柱帽，下端止水，装入一定量的蒸馏水，把凝胶边搅拌边倒入住中，装柱至12cm左右，使凝胶始终在溶液中，待肉眼可见的凝胶沉降完成后，旋上上端柱帽并连上洗脱系统，平衡洗脱约20min。调节流速为6滴/分。 2） 上样：打开层析柱上面的柱帽，放入略小于层析柱内径的滤纸片，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，利用恒流泵加速按钮使洗脱面与胶床表面相切甚至相齐时，停止洗脱，吸取0.5~1ml还原层试剂，小心注入凝胶床面中央，加样完毕，开始洗脱，待液面与凝胶床面相切时，加入1ml的磷酸洗脱液，待液面与凝胶床面再次相齐时，加入0.5~1ml的血红蛋白样品，待样液与凝胶床面相切时，加入1ml磷酸洗脱液，之后再加入5ml磷酸洗脱液，盖上柱帽，连续洗脱。 四、 实验结果及计算： 在开始洗脱时，为暗红色棕色层（如图1）；逐渐变为由下向上鲜红 5 / 6 -棕色-黄色层（如图2）；最后变为自下向上鲜红-紫-黄色层（如图3）。洗脱后得到鲜红色血红蛋白，和黄色还原层溶液。 五、 结果分析： 本实验中，通过凝胶过滤，用还原剂FeSO4处理血红蛋白，在层析柱中加入含有还原剂的溶液，使形成一个还原区带，当血红蛋白样品（血红蛋白与铁氰化钾的混合液）流经还原区带时，褐色的高铁血红蛋白立即生成紫色的还原型血红蛋白，还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧分子结合形成鲜红色的氧合血红蛋白，铁氰化钾则因分子量小，呈黄色带落在后面。 六、 参考文献： 1、 谢作听 王春香，《两次微柱凝胶法在红细胞Rh血型嵌合体鉴定中的应用》，Chinese journal of clinical laboratory science 2003 21(1) R457.11 2、 曹成喜 等，《生物化学仪器分析基础》，2008，化学工业出版社 3、 孙培龙 吴石金，《生物化学技术实验指导》，2008，化学工业出版社 4、 张龙翔 张庭芳 李玲媛，《生化试验方法和技术》，1997，高等教育出版社 5、 百度百科（/view/81744.htm） 七、 思考题： 层析柱技术操作关键步骤和操作要领及技巧：1）装柱时一方面要注意装柱的量要适宜，过多过滤过慢，过少，分离不充分，另一方面要注意要使凝胶始终处于溶液中；2）控制流速，过快无法分离完全；3）加液时要等到液面与胶床相切时，停止洗脱加液，要小心控 6 / 6 制防止液面低于胶床，造成裂柱，加液时要轻缓，防止破坏胶柱。 八、 实验小结： 凝胶过滤作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解了凝胶过滤是一种按照分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，用缓冲液洗脱，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的的操作方法与原理。 本次实验较之前几次实验简单一些，用时也较少，由于不是定量试验而是观察现象，试验压力也小一些，之前也听其他做过实验的同学介绍过经验，所以实验进行的比较顺利。也得到了老师在实验过程中的表扬。
6 - 6 - 实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
3.1 相关基础知识
凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析，是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。 7 - 7 - 分配系数Kav既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要测出床体积Vt 和外水体积Vo 以及洗脱体积Ve，即可计算出Kav值。而凝胶床总体积Vt可用二种方法得到：
血红蛋白的测定方法
血红蛋白是一种色素蛋白，可以用比色法测定。血液中血红蛋白以各种形式存在，包括氧合血红蛋白、碳氧血红蛋白、高铁血红蛋白或其他衍生物。
1)氰化高铁血红蛋白(HiCN)测定法：血液中除了SHb以外，其他各种血红蛋白均可被试剂转化、生成HiCN，其最大的吸收峰为540nm波长，可经比色测定。此法为国际血液学标准化委员会 (ICSH)推荐的国际标准参考方法，操作简单，显色快且结果稳定;但本法试剂中KCN有剧毒，测定过程中高白细胞和高球蛋白血症易致混浊，HbCO转化较慢。
2)十二烷基月桂酰硫酸钠血红蛋白(SLS-Hb)法：除SHb外，血液中各种Hb均可与低浓度十二烷基月桂酰硫酸钠(SLS)作用，生成SLS-Hb棕红色化合物。SLS-Hb最大吸收波峰538nm，波谷500nm，肩峰560nm.由于摩尔消光系数尚未最后确认，因此不能用吸光度“A”值直接计算血红蛋白浓度。本法操作简单，呈色稳定，准确性和精确性符合要求，且无公害。但SDS质量差异较大，并且SDS可破坏白细胞，不适合进行白细胞计数的血液分析仪使用。
3)叠氮高铁血红蛋白(HiN3)测定法：与HiCN法相似，但仍然有公害问题。
4)碱羟血红蛋白(AHD 575nm)测定法：试剂简单、不含有毒试剂、呈色稳定，但由于其吸收峰在575nm，限制了此法在血液分析仪的使用。
5)溴代十六烷基三甲胺(CTAB)血红蛋白测定法： 该法试剂溶血性强又不破坏白细胞，可同时进行白细胞计数，可用于血细胞分析仪自动检测Hb和白细胞。缺点是对Hb测定结果的准确度和精密度较低。 近年来，多参数血细胞分析仪的应用，使Hb测定逐步以仪器法取代手工法，其优点是操作简单、快速，同时可以获得多项红细胞的参数，血液分析仪法测定血红蛋白的原理与手工法原理相似，多采用HiCN法，但由于各型号仪器使用的溶血剂不同，形成Hb的衍生物不同。某些溶血剂形成的衍生物稳定性较差，因此要严格控制溶血剂加入量及溶血时间，特别是半自动血细胞分析仪应严格控制实验条件。有些溶血剂内虽加入了KCN，但其衍生物并非是HiCN，仪器要经过HiCN标准液校正后，才能进行Hb测定。仪器法测定血红蛋白精确度CV约为1%.
实验报告
课程名称：生化实验B 实验日期：
班级： 姓名学号：
血红蛋白凝胶过滤
一、 背景及目的
血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。1
凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度
2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH
6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
影响凝胶过滤的因素主要有：
1、 层析柱的选择 ：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。
2、 加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、 洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：
1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复性
