玉米Dof转录因子家族基因的全基因组分析

玉米自交系B73全基因组cystatin抗虫基因家族分析黑龙江农业科学2010(8):10～13 HeilongjiangAgriculturalSciences◆生物技术◆玉米自交系B73全基因组cystatin抗虫基因家族分析于金海(黑龙江省农业科学院作物育种研究所,黑龙江哈尔滨150086)摘要:半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因具有cystatin结构特征的蛋白结构域,广泛存在于植物或动物体内.此类基因在植物或动物蛋白质组中具有多个功能各异的家族成员,并在抗虫中扮演重要角色.通过利用玉米B73全基因组的基因表达序列数据,对12个cystatin基因的结构组成,染色体分布,系统进化等进行了分析.鉴定了该基因家族在蛋白序列间3个高度保守基序,构建了基因家族系统进化树,为该重要基因家族的进化提供了依据的同时也为克隆和分离该类抗虫基因提供参考. 关键词:玉米;cystatin基因;全基因组;抗虫;基因家族中图分类号:S513文献标识码:A文章编号:1002—2767(2010)08一O01O—O4虫害严重影响农作物的产量和品质,制约农业经济的发展.长期以来人们普遍采用化学杀虫的方法来控制害虫,但由于农药的大量使用也带来了农药残留,害虫产生抗药性,自然环境被污染等严重问题.为避免这些缺点,育种家尝试利用转基因方法来提高农作物的抗虫性.自从1983年首次获得转基因植物以来,植物抗虫基因工程育种已成为作物抗虫育种研究的热点.目前,已经分离克隆的多种抗虫基因,主要为蛋白酶抑制剂基因引.蛋白酶抑制剂是一类具有抑制蛋白酶活性的物质,植物蛋白酶抑制剂是一种能够抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白或多肽.根据作用于酶的活性基团不同又可将植物中的蛋白酶抑制剂基因分为4类,即丝氨酸类,半胱氨酸类,天门冬氨酸类和金属类.其中,半胱氨酸类蛋白酶抑制剂(cystatin)对以半胱氨酸类蛋白酶为主要消化酶的鞘翅目昆虫的防治具有重要作用l6].而由于半胱氨酸蛋白酶抑制剂不影响哺乳动物包括人类消化酶的活性,因而备受青睐.目前,玉米和水稻的cystatin基因的cDNA都已被克隆.,而且二者具有很高的同源性.通过植物来源的抗虫基因间与其它来源的抗虫基因的联合使用,培育抗虫作物提高抗虫性已成为现实[1].不断发现和克隆新的抗虫基因将是今后植物抗虫育种领域研究的重点,由于农作收稿日期:2010—04—26作者简介:于金海(1971-),男,黑龙江省密山市人,学士,助理研究员,从事玉米遗传育种研究.E—mail:hnygy@163. corn.1O物本身天然抗虫机制的存在,作物本身将会是今后人们发掘更多抗虫基因的重要来源.尤其是随着全基因组测序计划的完成_1,为发掘更多的抗虫基因提供了可能.该研究采用生物信息学方法,利用玉米自交系B73全基因测序结果,全面分析了半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因家族的分布,结构以及系统进化等,为研究该基因家族的进化和分离新功能基因提供参考.1材料与方法1.1基因表达数据的获得以玉米自交系B73全基因组表达序列为研究对象,全基因组数据库来自玉米测序网站ht—tp:///index.html,共获得了玉米53764个基因的表达序列,拟翻译蛋白序列以及基因全长序列.利用Interproscan软件预测这些基因所编码的蛋白序列的结构域,共获得玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因12个,同时提取基因的全长序列和蛋白序列.1.2序列分析1.2.1蛋白结构域分析利用MEME/MAST程序(MotifdiscoverandsearchV4.3.0,http:///meme4—3～O/cgi—bin/meme.cgi)Ds],对玉米Cystatin蛋白全序列进行分析,鉴定蛋白序列包含的基序(motif),基序数目限制在30个,基序长度限制在2O～100个氨基酸残基,单个结构域在序列间的分布取任意值.1.2.2构建系统进化树采用CLUSTALw(Vl_83)程序对氨基酸全序列进行联配,参数默认.采用邻位相连法构建系统进化树,并利用TreeView软件显示系统发生树.8期-t-.~:玉米自交系B73全基因组cystatin抗虫基因家族分析◆生物技术◆2结果与分析2.1玉米cystatin基因的鉴定从玉米B73中鉴定的12个cystatin基因分别命名为ZmCYS1～12,12个ZmCYS基因在玉米全基因组中的分布情况及基因长度,外显子数目见表1,可知,玉米ZmCYS基因长度介于554～6211 bp,基因长度最大的是ZmCYS4基因,为6211bp,长度最小的是ZrnCYS12,为554bp.从基因在染色体分布看,ZmCYS基因家族成员在基因组中分布并不均匀,其中,玉米ZmCYS基因在第8染色体分布最多,有4个基因位于该染色体上;其次是第1 染色体,有3个基因成簇分布在该染色体上.第6染色体上有2个CyS基因,第3,4,9染色体上各有1个ZmCYS基因.从基因结构看,8个(66.7)ZCyLs基因的外显子数为1个或2个,外显子数最多的为ZmCYS9基因,为4个,其余3个基因有3个外显子.4个ZmCYS基因还存在可变剪切情况(见表2),其中ZmCYS4,ZCYS6和ZCyS11存在2种可变剪切,ZCYS4和Zm—Cy511基因可变剪切产物相同,长度分别为135和176个氨基酸,而ZrnCYS6基因2种可变剪切产生的蛋白产物不同,分别为225和245个氨基酸. ZmCYS9基因存在4种可变剪切,产生3种蛋白产物,分别为150,164和173个氨基酸.表1玉米B73基因组中cystatin基因及其基本信息11◆生物技术◆黑龙江农业科学8期2.2玉米cystatin蛋白的结构域从一级结构上看,12个ZmCyS基因编码的蛋白质差别不大,具有105～245个氨基酸残基.对这些氨基酸进行基序分析表明,这12个基因所编码的蛋白主要包含3种基序,这些基序的结构见图l,这3个基序提取到的一致序列见表3,其中基序1中含有cystatin基因标志性基序”QVV AG”,这也是该基因家族的活性位点.从图1可以看出,Zm—CYS1等8个基因包含全部3种基序,排列顺序为3—1—2.ZmCYS6,ZInCy59和ZmCYSl1基因只含有1,2基序,缺失基序3.而ZrnCYS5则含有基序3和1,缺失基序2.这3个基序所在位置基本对应cystatin的基本结构域,ZrnCYS9基因含有2个cystatin基本结构域,其它l1个基因都只含有1 个.9个基因的蛋白起始区包含23～33个氨基酸残基的信号肽,而ZmCYS2,ZmCYS7和ZmCYS10 则不包含信号肽,ZmCYIO基因在58～80处氨基酸残基处有一个跨膜区域.12ZmCyS1ZmCyzmCys32rmCyS4ZmCzmCY贷ZmCyL研ZmCys8ZmCyS9ZmC1,SlOZmCYSl1ZmCySl2图1Cystatin蛋白保守基序分布图表3MEME/MAST分析提取的cystatin蛋白保守基序基序编号共有序列lRFA V AEHNKKANAGLEFERVVKGKEQV—V AGTL YDL TLEAKD2AGKKKL YEAKVWEKPWEDFKELQEFAPV 3NENDPHIQELG2.3玉米cystatin蛋白的系统发生分析为了解玉米cystatin基因的系统进化关系,利用ClustalW对该基因家族的12个成员所编码的18种蛋白进行了系统发生分析,构建了系统发生树(见图2).根据图2所呈现的进化关系的远近,可将玉米cystatin基因分成4个亚族,分别用G1～G4表示.其中,第1亚族(G1)中包含的成员最多,共含有4个基因分别为ZmCYS4,Zm—Cy55,ZC8和ZmCYS11的6个蛋白序列.第2亚族包含ZmCYS1,ZInCYS3和ZInCYS7. 第3亚族包含ZmCYS6和ZmCYS9基因的6个蛋白,可见同一基因不同剪切所得蛋白亲缘关系较近.第4亚族包含3个成员,分别为ZrnCYS2, ZmCyS10和ZmCYS12.图2玉米Cystatin蛋白系统发生树ZmCyS5ZmC璐ZmCyS4一lZmC4—2ZmCySlI—lZmCySll一2ZmCySlZmCys3zmCYZmCY9一lZmCyS9—2zmCYS6—4“CS6—3ZmC1,95-lZmCYS6—2ZmCYSl2Z而CySl0ZmCyS2∞,●●●●●r●●●●J,●LrJ8期于金海:玉米自交系B73全基因组cystatin抗虫基因家族分析◆生物技术◆3结论与讨论利用生物信息学方法,在玉米自交系B73的全基因组中共找到12个cystatin基因,这与在水稻全基因组中发现的cystatin基因的数量一致[1,数量上明显少于抗病基因1.根据玉米cystatin基因编码蛋白的系统发生树分析可以看出,位于同一亚族的基因序列相互间的距离均小于它们与其它序列之间的距离,被认为具有相似结构与功能的直系同源簇.玉米cystatin基因家族在长期进化过程中已表现出结构上的一些差异,个别基因内部也发生了复制现象.该研究利用多重联配以及MEME分析表明,cystatin基因蛋白家族中存在高度保守的基序,尤其是QVVxG基序在所有的cystatin基因中非常保守.这些不同的保守基序可能与基因的特定功能相关.此外,对cystatin基因的表达情况进行了探索,在GenBank数据库中发现26个cystatin基因的表达序列标签,分别来自种子,胚,叶片和根,这些组织是受昆虫侵害较多的部位,在这些部位表达有助于增强对昆虫的抗性.该研究对所鉴定的cystatin基因家族结构进行的系统分析将有助于对该基因的克隆和分离,对玉米抗虫育种具有参考价值.参考文献:[13V aeckM,ReynaertsA,HermanH,eta1.Transgenieplants protectedfrominsectattack.EJ].Nature,1987,328:33—37. [23HilderVA,GatehouseAMR,SheermanSE,eta1.Anovel mechanismofinsectresistanceengineeredintotobacooEJ]. Nature,l987,33:16O一163.[3]高越峰.朱祯,肖桂芳,等.大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用EJ].植物学报,1998,40(5):404—406.[4]RaoKV,RathoreKS,HodgesTK,eta1.Expressionof snowdroplectin(GNA)intransgenicriceplantsconfersre—sistancetoricebrownplanthopper[J].PlantJounal,1998,15(4):469—477.[5][6][73梁辉,朱银峰,朱祯,等.雪莲花凝集素基因转化小麦及转基因小麦抗蚜性的研究[J].遗传学报,2004,3l(2):189—195. RyanCA.Proteinaseinhibitorgenefamilies,strategiesfor transformationimproveplantdefenseagainstherb—ivores[J].Bioessays,1989,10(1):20-22.ChenMS,JohnsonB,WenL,eta1.Ricecystatin:bacterial expression,purification,cysteineproteinaseinhibitoryactiv—ity,andinsectgrowthsuppressingactivityofatruncated formoftheprotein[J3.ProteinExprPurif,1992,3(1):4l一49.1-83TakafumiY,HiroyukiO,AzusaS,eta1.ACysteineProtease fromMaizeIsolatedinaComplexwithCystatin[J].Plantand CellPhysiology,2000,41(2):185—191.[93MassonneauA,CondamineP,WisniewskiJP,eta1.Maizecystatinsrespondtodevelopmentalcues,coldstressanddrought[J].BiochimBiophysActa,2005,1729(3):186—199.[1O]SadamiO,MayumiT,TomokazuK,eta1.Oryzacystatin-II,a CystatinfloraRice(O~yzasativaL.japonica),IsaDimeric Protein:PossibleInvolvementoftheInterconversionbetween DimerandMonomerintheRegulationoftheReactivityof Oryzacystatia-II[J].JounalAgricFoodChem,2007,55(5):1762一l766.[11]卢晓风,夏玉先,裴炎.植物蛋白酶抑制剂在植物抗虫与抗病中的作用[J].生物化学与生物物理学进展,1998,25(4):328—333.[12]柳武革,薛庆中.蛋白酶抑制剂及其在抗虫基因工程中的应用[J].生物技术通报,2000(1):20—25.[133达克东,崔德才,张松,等.超强表达豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)转化苹果的研究口].园艺学报,2001,28(1): 57—58.r14]PatrickS,SchnableDW,RobertS,eta1.TheB73Maize Genome:Complexity,Diversity,andDynamics[J3.Science, 2009,326:l112—1115.[153BaileyTI,,biningevidenceusingP—val—ues:applicationtosequenceshomologysearches[J].Bioin—formatics,1998,14:48—54.[16]杨泽峰,顾世梁,许花,等.拟南芥和水稻cystatin基因家族的生物信息学分析[J].扬州大学学报,2007.28(3):51—57.[17]汪结明,江海洋,赵阳,等.玉米自交系B73全基因组NBS类型抗病基因分析[J].作物学报,2009,35(3):566—570.[18]LedentV,PaquetO,V envoortM.Phylogeneticanalysisof thehumanbasichelixqoop—holixproteins[J].GenomeBi—ology,2002,3(6):30-38.Genon~WideAnalysisofcystatinGeneFamilyinMaizeInbredLineB73Y uJin-hai (CropBreedingInstituteofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences, Harbin,Hei—longjiang150086)Abstract:Cystatingenesarecysteineproteinaseinhibitorswithaproteinpatte rnofcystatin-containingdomain, whichexistwidelyinmanyproteinsfromplantsandanimals.Thisproteinhas manydifferentfamilymembers distributinginplantandanimalproteome,andplayskeyrolesinplantsagainst pests.Here,weidentifiedcom—pletesetof12differentcystatingeneinthemaize(ZeamaysL.)inbredlineB73 genome.Theputativecystatin geneswerecharacterizedwithrespecttostructuraldiversity,chromosomedistribution,phylogeneticrelation—shipandsoon.Threeconservedmotifswerefoundamongproteinsofcystating eneofmaize.Phylogeneticanal- ysisoftheseproteinsindicatedthatfourgroupsexist.Theresultsofthisstudyw illprovideevidenceforevolu—tionforcystatingenefamilyinmaizeandbenefitforseparatingandcloningresi stancegenetodefendthein—sects.Keywords:maize;cystatingene;genomewide;insect—resistance;genefam ilyl3。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(5): 772−777 /zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@This work was supported by the grants of “863” High-tech Program (No. 2006AA10A106), the China National Fundamental Fund of Personnel Training (No. J0730649) and partly supported by the open funds of the National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement. Corresponding author: ZHENG Yong-Lian, E-mail: zhyl@ Received(收稿日期): 2010-10-23; Accepted(接受日期): 2011-03-08.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00772Genome-wide Analysis of MuDR -related Transposable Elements Insertion Population in MaizeFENG Jing 1, FU Xue-Qian 1, WANG Ting-Ting 2, TAO Yong-Sheng 2, GAO You-Jun 1, and ZHENG Yong-Lian 1,*1National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2 Hebei Research Station ofNational Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, ChinaAbstract: Insertional mutagenesis has now been widely used to knockout genes for functional genomics. The maize Mutator transposons hold an advantage of high activity to construct large mutant libraries. In this study, a MuDR line was used to cross with an elite Chinese maize inbred line Z31. A total of 1 000 M 1 individuals were planted and self-pollinated to generate their M 2 fami-lies. Experiments were conducted to investigate the insertion specificity of MuDR related transposable elements. Six hundred and ninety-five MuDR inserted flanking sequences were isolated with a modified MuTAIL-PCR method and analyzed with bioinfor-matics. Three hundred and seventy-four non-redundant insertion sites were identified and 298 of them were mapped to a single locus on the integrated maize map. The results revealed some prominent features of the MuDR -related insertions of maize: random dis-tribution across the 10 chromosomes, preferential insertion into genic sequence and favoring some classes of functional genes. Keywords: Zea mays ; Mutator (Mu ) transposons; MuDR elements; Flanking sequence; Insertion sites; Mu TAIL-PCR全基因组分析玉米MuDR 转座因子插入突变体库冯 静1 傅学乾1 王婷婷2 陶勇生2 高友军1 郑用琏1,*1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉430070; 2河北农业大学作物遗传改良国家重点实验室河北实验基地, 河北保定071000摘 要: 在功能基因组研究中, 插入诱变被广泛用于基因敲除。

邬　奇，孙扬名，桑俊伟，等．玉米叶片硝酸盐积累性状的全基因组关联分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（３）：４７－５２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０３．００７玉米叶片硝酸盐积累性状的全基因组关联分析邬　奇１，孙扬名１，桑俊伟３，周　玲１，赵　涵１，２（１．江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所，江苏南京２１００１４；２．南京农业大学农学院，江苏南京２１００９５；３．扬州大学生命科学学院，江苏扬州２２５００９） 摘要：为鉴定筛选调控玉米氮素吸收代谢相关位点和基因，以遗传来源广泛的３５０份玉米自交系为材料，利用玉米５５ＫＳＮＰ芯片，对玉米叶片硝酸盐积累性状进行基于Ｑ＋Ｋ混合线性模型的全基因组关联分析。

结果表明，３５０份玉米自交系构成的自然群体具有广泛的遗传多样性，３次重复测量的叶片硝酸盐含量均表现出良好的正态分布特性。

叶片硝酸盐的全基因组关联分析显示，共有２７个稳定的ＳＮＰ位点与玉米叶片硝酸盐积累显著相关，这２７个位点共分布在玉米６条染色体上，其中１６个集中在４号染色体上。

对９个极显著关联［－ｌｇＰ≥５．５］位点基因进行氮响应相对表达分析，有８个基因表现出显著氮响应特性，其中３个基因响应达到极显著水平，分别较对照提高３．５４、２ ７４、２．０２倍，对应已注释的基因分别为ＮＡＣ７９、ＧＡ２０ｏｘ７和ＰＲＥＰ２，表明它们可能在氮素吸收代谢的调控中发挥作用。

相关研究结果可作为玉米硝酸盐吸收代谢研究的重要候选基因进行功能验证，对开发氮高效分子标记及育种利用具有重要意义。

关键词：玉米；硝酸盐；全基因组关联分析；ＳＮＰ；候选基因 中图分类号：Ｓ５１３．０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２４）０３－００４７－０６收稿日期：２０２３－０４－１２基金项目：国家自然科学基金（编号：３２２７２１３３、３２１０１６４４）；江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目（编号：ＪＢＧＳ［２０２１］０１２）；江苏省重点研发计划（现代农业）重点项目（编号：ＢＥ２０２２３４３）。

报告从20世纪80年代开始，分子标记系统的开发使植物育种者和分子生物学家获得多态性标记的数量大大增加。

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）已经在数量性状基因座（Quantitative trait locus，QTL）中广泛使用。

目前已有多项研究结果表明，超过10 000个不同标记系统的QTL 应用于12种植物中，旨在改善具有重要经济价值的数量性状。

最初，通过应用MAS 将分子标记整合到传统的表型选择（Phenotypic selection，PS）中。

对于简单的性状，MAS 只选择具有主要作用的QTL 相关标记的个体，不使用与性状无显著相关的标记的个体。

由于QTL 与环境相互作用，难以在多种环境中或不同的遗传背景下找到相同的QTL，通过使用QTL 相关标记检测来改善多基因控制的复杂数量性状是不可行的，因此，新的MAS 技术-基因组选择（GS）应运而生。

Meuwissen 等首次提出了GS 育种策略，GS 育种分为两步。

第一步主要是利用训练群体的基因分型结果和表型建立最佳线性无偏预测（Best linear unbiased prediction，BLUP ）模型，得到训练的育种值（Breeding value，BV）。

第二组是育种群体的基因型数据，但群体中的个体均没有表型，基于BLUP 模型和与训练群体中的表型相关的基因组的等位基因同一性来预测育种群体的各种性状的表现，从而得到GEBV ，GEBV 来源于预测群体中每个个体的基因组中发生的有用基因组的组合，并且提供了每个个体具有优良表型的估计值，即高育种值。

可以根据GEBV 选择新的育种亲本。

GS 与传统的MAS 相比有以下优点：①GS 不需要QTL 定位。

GS 不同于连锁和关联作图的策略，它不是映射单个基因效应，而是基于大量分子标记对有效育种值进行估计，理想地覆盖全基因组。

②GS 更精确，特别是对于早期选择。

Dof转录因子研究进展李跃;李国瑞;黄凤兰;孙华军;邢超;丛安琪;李威;陈永胜【摘要】Dof(DNA Binding with one finger)转录因子是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育过程中扮演重要作用,如种子萌发、光响应、贮藏蛋白积累、生物胁迫、碳氮代谢等.介绍了Dof转录因子的结构,并综述了其对植物的调控作用,以期为Dof转录因子的进一步研究提供理论依据.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(000)007【总页数】2页(P96-97)【关键词】Dof转录因子;生长发育;结构;调控作用【作者】李跃;李国瑞;黄凤兰;孙华军;邢超;丛安琪;李威;陈永胜【作者单位】内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学农学院,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室,内蒙古通辽028000【正文语种】中文【中图分类】S188Dof(DNA Binding with one finger)转录因子是植物特有的一类转录因子，在动物和酵母中并不存在。

因其含有一个单锌指结构，因此被称为Dof。

转录因子(Transcription factor)是能够保证目的基因以特定的强度在特定的时间和空间表达的蛋白质分子。

西北植物学报，2021 ,4 1 (5.) =0738 — 0745Acta Bot. Boreal. -Occident. Sin.doi ： 10. 7606/j. issn. 1000-4025. 2021.05. 0738http ：//xlzwxb. alljournal. net玉米转录因子基因ZmMYB 308的克隆及表达分析王新涛杨 青2,代资举3,李保叶郝俊杰1*收稿日期=2021-01-29；修改稿收到日期：2021-04-20基金项目：河南省科技攻关计划(192102110026 ,021********)；河南省农业科学院科研发展专项(2020CY011.2020YQ33)作者简介：王新涛(1983—)男，博士，助理研究员，主要从事玉米分子遗传育种o E-mail ： tao-450002@163. com *通信作者：郝俊杰，博士，研究员，主要从事玉米病害研究。

E-mail ： ha )jjds@ 163. com（1河南省农业科学院植物保护研究所，郑州450002；河南省农业科学院芝麻研究中心，郑州450002； 3河南省作物分子育种研究院，郑州450002）摘要:MYB 类转录因子广泛地参与了植物生长发育的许多重要过程，在调控木质素合成途径中也起着重要作用。

为探索MYB 转录因子在玉米发育中的功能，该研究利用玉米茎秆转录组测序数据，对玉米茎秆发育过程中差异表达的MYB 转录因子进行筛选和分析，在此基础上，通过RT-PCR 方法克隆获得了 ZmMYB 308基因。

结果表明：（）共检测到14个差异表达的MYB 转录因子，其中10个下调表达，4个上调表达。

（2）ZmM y B 308基因包含一个74 7 Ip 的开放阅读框，可编码248个氨基酸，相对分子质量27.01 kl ）,等电点为9. 17；系统进化树比对表明,玉米ZmMYB308蛋白和谷子SiMYB308蛋白的亲缘关系较近，相似性高达94%。

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１２):１~８ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１２.００１收稿日期:２０２３－０１－０６基金项目:山东省重点研发计划项目 玉米抗锈病机制及绿色防控体系集成与应用 (２０２２ＣＸＧＣ０１０６０７)ꎻ国家自然科学基金青年基金项目 细胞分裂素调控植物气孔发育分子机理的研究 (３１９００２４９)ꎻ山东省农业科学院农业科技创新工程项目(ＣＸＧＣ２０２２Ｅ０２)作者简介:王文丽(１９９７ )ꎬ女ꎬ甘肃天水人ꎬ大学本科ꎬ研究方向为玉米遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:Ｗ１３８３０６６８６１７＠１６３.ｃｏｍ通信作者:刘巍(１９８８ )ꎬ男ꎬ吉林珲春人ꎬ硕士ꎬ主要从事植物病理学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:４１７７４２７０７＠ｑｑ.ｃｏｍ张恩盈(１９７６ )ꎬ男ꎬ山东德州人ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事玉米遗传育种与生物信息学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:１９００７７９７３＠ｑｑ.ｃｏｍ玉米ＺｍＷＲＫＹ３６基因的生物信息学及功能分析王文丽１ꎬ２ꎬ穆春华２ꎬ张发军２ꎬ刘霞２ꎬ冷冰莹２ꎬ姚国旗２ꎬ闫振伟２ꎬ刘巍３ꎬ王昀４ꎬ张恩盈１(１.青岛农业大学农学院ꎬ山东青岛㊀２６６１０９ꎻ２.山东省农业科学院玉米研究所/小麦玉米国家工程实验室/农业部黄淮海北部玉米生物学与遗传育种重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.中化化肥有限公司吉林分公司ꎬ吉林长春㊀１３０１１９ꎻ４.安丘市农产品质量安全管理服务中心ꎬ山东安丘㊀２６２１００)㊀㊀摘要:作为植物转录因子家族最大的成员之一ꎬＷＲＫＹ蛋白在植物的生长发育㊁防御反应以及胁迫响应中都发挥着极为关键的作用ꎮ本研究以玉米自交系Ｂ７３为材料ꎬ克隆了一个玉米ＷＲＫＹ转录因子Ｚｍ￣ＷＲＫＹ３６ꎬ并对其进行生物信息学与功能分析ꎮ结果表明ꎬＺｍＷＲＫＹ３６基因的开放阅读框为１００２ｂｐꎬ编码３３３个氨基酸ꎮＺｍＷＲＫＹ３６蛋白分子量为３５.８ｋＤａꎬ理论等电点为５.６６ꎬ属于酸性蛋白ꎻ不稳定系数为６７.１６ꎬ为极不稳定蛋白ꎻ亲水指数为－０.５２６ꎬ为亲水性蛋白ꎻ具有１个ＷＲＫＹ结构域和１个Ｃ２ＨＣ锌指结构基序ꎬ属于ＷＲＫＹ转录因子Ⅲ类亚家族成员ꎻ与高粱ＳｂＷＲＫＹ６４㊁稷ＰｍＷＲＫＹ４和狗尾草ＳｖＷＲＫＹ４有着较近的亲缘关系ꎮ进一步分析发现ꎬＺｍＷＲＫＹ３６蛋白定位于细胞核内ꎬ并且有着较强的转录激活活性ꎮｑＲＴ－ＰＣＲ结果显示ꎬＺｍＷＲＫＹ３６基因在玉米根和叶中表达量较高ꎬ具有组织特异性ꎻ并且受到干旱胁迫和盐胁迫的显著诱导ꎬ表明转录因子ＺｍＷＲＫＹ３６可能在玉米抵御外界干旱胁迫和盐胁迫的过程中发挥着重要作用ꎮ关键词:玉米ꎻＺｍＷＲＫＹ３６ꎻ生物信息学分析ꎻ功能分析ꎻ干旱胁迫ꎻ盐胁迫中图分类号:Ｓ５１３:Ｑ７８㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１２－０００１－０８ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＺｍＷＲＫＹ３６ＧｅｎｅｉｎＭａｉｚｅＷａｎｇＷｅｎｌｉ１ꎬ２ꎬＭｕＣｈｕｎｈｕａ２ꎬＺｈａｎｇＦａｊｕｎ２ꎬＬｉｕＸｉａ２ꎬＬｅｎｇＢｉｎｇｙｉｎｇ２ꎬＹａｏＧｕｏｑｉ２ꎬＹａｎＺｈｅｎｗｅｉ２ꎬＬｉｕＷｅｉ３ꎬＷａｎｇＹｕｎ４ꎬＺｈａｎｇＥｎｙｉｎｇ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙꎬＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６１０９ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＭａｉｚｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔａｎｄＭａｉｚｅ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＭａｉｚｅｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＨｕａｎｇ￣Ｈｕａｉ￣ＨａｉＲｅｇｉｏｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＪｉｌｉｎＢｒａｎｃｈｏｆＳｉｎｏｃｈｅｍＦｅｒｔｉｌｉｚｅｒＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＣｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１９ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＡｎｑｉｕＡｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔＱｕａｌｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙＭａｎａｇｅｍｅｎｔａｎｄＳｅｒｖｉｃｅＣｅｎｔｅｒꎬＡｎｑｉｕ２６２１００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＡｓｏｎｅｏｆｔｈｅｌａｒｇｅｓｔｆａｍｉｌｉｅｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｐｌａｎｔꎬｔｈｅＷＲＫＹｐｒｏｔｅｉｎｓｐｌａｙｃｒｕｃｉａｌｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬｄｅｆｅｎｓｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ.ＩｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈꎬｗｅｃｌｏｎｅｄａｍａｉｚｅＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅＺｍＷＲＫＹ３６ꎬａｎｄｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆＺｍＷＲＫＹ３６ｇｅｎｅｗａｓ１００２ｂｐꎬａｎｄｉｔｅｎｃｏｄｅｄ３３３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆＺｍＷＲＫＹ３６ｗａｓ３５.８ｋＤａꎬａｎｄｉｔｓｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｗａｓ５.６６ꎬｓｏｉｔｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏａｎａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎꎻｉｔｓｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｗａｓ６７.１６ꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｉｔｗａｓａｈｉｇｈｌｙｕｎｓｔａｂｌｅｐｒｏ￣ｔｅｉｎꎻｉｔｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙｉｎｄｅｘｗａｓ￣０.５２６ꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｉｔｗａｓａｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎꎻｉｔｃｏｎｔａｉｎｅｄｏｎｅＷＲＫＹｄｏｍａｉｎａｎｄｏｎｅＣ２ＨＣｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆꎬｓｏｉｔｗａｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｓｕｂｇｒｏｕｐⅢｆａｍｉｌｙｏｆＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎻｉｔｓｈｏｗｅｄｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｗｉｔｈＳｂＷＲＫＹ６４ꎬＰｍＷＲＫＹ４ａｎｄＳｖＷＲＫＹ４.ＦｕｒｔｈｅｒａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＺｍＷＲＫＹ３６ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓａｎｄｈａｄｓｔｒｏｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＺｍＷＲＫＹ３６ｇｅｎｅｗａｓｔｉｓｓｕｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｌｅｖｅｌｉｎｒｏｏｔａｎｄｌｅａｖｅｓꎬａｎｄｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎬｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＺｍＷＲＫＹ３６ｍｉｇｈｔｐｌａｙａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍａｉｚｅｒｅｓｉｓｔｉｎｇｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＭａｉｚｅꎻＺｍＷＲＫＹ３６ꎻＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓꎻＤｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓꎻＳａｌｔｓｔｒｅｓｓ㊀㊀ＷＲＫＹ转录因子家族是植物转录因子家族中最大的家族之一ꎬ因其特殊的保守七肽ＷＲＫＹＧＱＫ而得名ꎬ已在拟南芥㊁水稻和玉米等许多物种中被鉴定出来[１－３]ꎮＷＲＫＹ转录因子最显著的一个特征就是存在高度保守的ＷＲＫＹ结构域ꎮ该结构域由约６０个氨基酸残基组成ꎬＮ端存在一个高度保守的七肽(ＷＲＫＹＧＱＫ)ꎬＣ端则存在一个新的锌指结构基序Ｃ２Ｈ２(Ｃ－Ｘ４－５－Ｃ－Ｘ２２－２３－Ｈ－Ｘ－Ｈ)或者Ｃ２ＨＣ(Ｃ－Ｘ７－Ｃ－Ｘ２３－Ｈ－Ｘ－Ｃ)[４－６]ꎮ根据ＷＲＫＹ结构域的数量和锌指结构基序的类型ꎬ可将ＷＲＫＹ转录因子分为３类主要的亚家族ꎬ其中ꎬⅠ类亚家族有２个包含Ｃ２Ｈ２类型锌指结构基序的ＷＲＫＹ结构域ꎬⅡ类亚家族有１个包含Ｃ２Ｈ２类型锌指结构基序的ＷＲＫＹ结构域ꎬⅢ类亚家族有１个包含Ｃ２ＨＣ类型锌指结构基序的ＷＲＫＹ结构域[６]ꎮ根据进化上的差异ꎬⅡ类ＷＲＫＹ转录因子亚家族又可进一步分为５个小组(Ⅱａ Ⅱｅ)[１ꎬ６]ꎮＷＲＫＹ转录因子通过直接结合到启动子上的Ｗ－ｂｏｘ[(Ｔ)ＴＧＡＣ(Ｃ/Ｔ)]元件调控靶基因的表达[４－６]ꎮ除了参与植物正常的生长发育以及代谢调节之外ꎬ近些年ꎬＷＲＫＹ转录因子也被证明广泛参与植物对多种非生物胁迫的响应ꎮ其中某些ＷＲＫＹ转录因子正调控干旱胁迫或者盐胁迫响应ꎬ例如:Ｌｉａｎｇ等[７]研究发现转录因子Ｄｇ￣ＷＲＫＹ５在菊花响应外界盐胁迫的过程中扮演正调控因子的角色ꎻＤａｉ等[８]证明转录因子Ｆｃ￣ＷＲＫＹ４０可以通过调控离子平衡和脯氨酸积累从而增强金柑植株对外界盐胁迫的耐性ꎻＧａｏ等[９]研究表明转录因子ＳｌＷＲＫＹ８在番茄抵御外界干旱胁迫和盐胁迫的过程中发挥着正调控因子的作用ꎬ可能是通过积累渗透调节物质(脯氨酸等)以及提高抗氧化酶活性来实现ꎻＺｈｕ等[１０]研究发现ꎬ葡萄可以通过过表达ＶｖＷＲＫＹ３０调节ＲＯＳ(活性氧)和渗透调节物质的积累ꎬ表现出对盐胁迫的抗性ꎮ另外ꎬ也有部分ＷＲＫＹ转录因子可能负调控盐胁迫响应ꎬ例如棉花转录因子Ｇｈ￣ＷＲＫＹ１７负调控植株对于外界干旱胁迫和盐胁迫的响应ꎬ并且可能是通过调控ＡＢＡ(脱落酸)信号转导和ＲＯＳ(活性氧)的产生来发挥作用[１１]ꎮ目前有关ＷＲＫＹ转录因子在拟南芥和水稻应对生物胁迫如病原菌侵染和多种非生物逆境胁迫过程中的功能研究较多ꎬ而其在玉米生长发育及胁迫响应中发挥的作用及其分子机制仍知之甚少ꎮ本研究以玉米自交系Ｂ７３为材料克隆了ＷＲＫＹ转录因子基因ＺｍＷＲＫＹ３６ꎬ随后对其进行生物信息学分析以及在干旱和盐胁迫下的表达分析ꎬ以期为挖掘玉米胁迫耐受关键基因㊁阐明其分子遗传调控网络及培育玉米抗逆品种奠定理论基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料及其胁迫处理和样品采集供试玉米材料为自交系Ｂ７３ꎮ胁迫处理试验于２０２２年６ ８月参考文献[１２]的方法进行ꎮ将玉米自交系Ｂ７３种植于山东省农业科学院植物培养室内ꎬ设置温度为２５ħ㊁光周期为１６ｈ光照/８ｈ黑暗㊁相对湿度为７０％ꎻ培养至三叶期时进行干旱胁迫和盐胁迫处理ꎬ以正常浇水的植株为对照ꎬ分别用２００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ溶液和２０％的ＰＥＧ６０００溶液浇灌幼苗ꎬ分别于处理０㊁１㊁３㊁６㊁１２ｈ取样ꎬ液氮速冻后于－８０ħ冰箱保存ꎮ组织表达模式试验于２０２２年６ １０月进行ꎮ将玉米自交系Ｂ７３种植于山东省农业科学院玉米研究所章丘试验基地ꎬ正常田间管理ꎬ分别收取２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀不同生长时期正常生长的玉米植株的根㊁茎㊁叶㊁花丝㊁花粉㊁果穗㊁胚和胚乳ꎬ液氮速冻后于－８０ħ冰箱保存ꎮ１.２㊀ＲＮＡ提取和ｑＲＴ－ＰＣＲ分析使用ＦａｓｔＰｕｒｅ ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｌａｎｔＴｏｔａｌＲＮＡＩ￣ｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ(南京诺唯赞生物科技有限公司)提取玉米组织的总ＲＮＡꎬ随后根据使用说明书ꎬ利用ＨｉＳｃｒｉｐｔ ⅢＲＴＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒｑＰＣＲ(＋ｇＤＮＡｗｉｐ￣ｅｒ)试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)反转录得到ｃＤＮＡꎮ使用特异性引物(表１)ꎬ利用ＣｈａｍＱＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ(南京诺唯赞生物科技有限公司)在荧光定量ＰＣＲ仪(Ｂｉｏ￣ＲａｄＣＦＸ９６)进行ＰＣＲ扩增ꎮ每次实验做３个技术性重复ꎬ并且分别完成３次独立的生物学重复ꎮ用ＺｍＡｃｔｉｎ作为内参基因ꎬ使用２－ΔΔＣｔ法计算基因的相对表达量[１３]ꎮ１.３㊀ＺｍＷＲＫＹ３６基因的克隆根据玉米遗传学和基因组学数据库ＭａｉｚｅＧＤＢ(ｈｔｔｐｓ://ｍａｉｚｅｇｄｂ.ｏｒｇ/)公布的基因序列ꎬ用ＤＮＡＭＡＮ软件设计全长编码区引物(表１)ꎬ以玉米叶片提取ＲＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ为模板ꎬ利用２ˑＰｈａｎｔａＭａｘＭａｓｔｅｒＭｉｘ(南京诺唯赞生物科技有限公司)对ＺｍＷＲＫＹ３６(ＧＲＭＺＭ２Ｇ１５８３２８)进行特异性扩增ꎮＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化回收ꎬ并将目的条带连接至Ｔ载体ꎬ进行菌落ＰＣＲ检测ꎬ选取阳性克隆进行测序ꎮ１.４㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的生物信息学分析利用在线预测网站ＥｘＰＡＳｙ分析ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的理化性质[１４]ꎻ利用在线工具ＳＯＰＭＡ分析其二级结构[１５]ꎻ利用在线工具ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ分析其三级结构[１６]ꎻ利用ＭＥＧＡ７.０软件构建ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白与其同源蛋白的系统进化树[１７]ꎬ并利用ＤＮＡ￣ＭＡＮ软件对其与同源蛋白进行序列比对[１８]ꎮ１.５㊀亚细胞定位将ＺｍＷＲＫＹ３６基因的全长编码区克隆到载体ｐＳｕｐｅｒ１３００－ＧＦＰ上ꎬ构建以烟草花叶病毒(ＣａＭＶ)３５Ｓ启动子驱动㊁以绿色荧光蛋白(ＧＦＰ)为标签的载体３５ＳʒʒＺｍＷＲＫＹ３６－ＧＦＰꎬ所用引物见表１[１９]ꎮ利用ＰＥＧ(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ)４０００介导的转化方法ꎬ将表达ＺｍＷＲＫＹ３６－ＧＦＰ融合蛋白或ＧＦＰ对照蛋白的载体分别与表达ｍＫＡＴＥ－ｍＣｈｅｒ￣ｒｙ融合蛋白(核定位标记)[２０]的载体共转化入玉米叶片的原生质体里[２１]ꎮ使用ＬＳＭ８８０型激光扫描共聚焦显微镜(蔡司ꎬ德国)观察荧光信号ꎮ１.６㊀转录激活活性分析将全长编码序列(１ ３３３ａａꎬＺｍＷＲＫＹ３６)㊁Ｎ端序列(１ １２０ａａꎬＺｍＷＲＫＹ３６－Ｎ)㊁Ｎ端加中间序列(１ １８６ａａꎬＺｍＷＲＫＹ３６－Ｎ＋Ｍ)㊁中间序列(１２１ １８６ａａꎬＺｍＷＲＫＹ３６－Ｍ)以及Ｃ端序列(１８６ ３３３ａａꎬＺｍＷＲＫＹ３６－Ｃ)分别克隆到载体ｐＧＢＫＴ７上ꎬ然后将相应的载体分别转化入酵母菌株Ｙ２ＨＧｏｌｄ中ꎮ转化后的酵母细胞涂布于ＳＤ－Ｔｒｐ培养基上ꎬ２８ħ培养箱倒置培养３天后筛选转化子ꎻ将筛选出的转化子在ＳＤ－Ｔｒｐ及ＳＤ－Ａｄｅ－Ｈｉｓ－Ｔｒｐ培养基上进行进一步筛选ꎬ并利用Ｘ－α－ｇａｌ染色检测半乳糖苷酶活性[２２]ꎮ酵母的初始浓度调整至０.１(ＯＤ６００)ꎬ在此基础上分别进行１０倍和１００倍稀释ꎬ滴定酵母菌液后ꎬ平板倒置放入２８ħ培养箱培养３天ꎮ空载体ｐＧＢＫＴ７为阴性对照ꎮ相关引物见表１ꎮ㊀㊀表１㊀引物信息引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)用途Ｑ－Ａｃｔｉｎ－ＦＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＡＡＴＧｑＲＴ－ＰＣＲ检测Ｑ－Ａｃｔｉｎ－ＲＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＣｑＲＴ－ＰＣＲ检测Ｑ－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＦＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＧＡｑＲＴ－ＰＣＲ检测Ｑ－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＲＣＡＴＧＴＡＣＣＧＴＡＣＧＴＡＴＧＴＴＴＣＧｑＲＴ－ＰＣＲ检测Ｔ－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＦＡＴＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＣＣ基因克隆Ｔ－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＲＧＣＡＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＧＴ基因克隆ｐＳｕｐｅｒ１３００－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＦＣＡＡＡＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＣＣ亚细胞定位ｐＳｕｐｅｒ１３００－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＲＣＡＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＧＴ亚细胞定位ｐＧＢＫＴ７－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＦＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＣＣ转录激活活性检测ｐＧＢＫＴ７－ＺｍＷＲＫＹ３６－ＲＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＧＴ转录激活活性检测ｐＧＢＫＴ７－ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｎ－ＲＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＣＴ转录激活活性检测ｐＧＢＫＴ７－ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｎ＋Ｍ－ＲＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＴＣＧＣＡＣＧＴＧＴＧＣ转录激活活性检测ｐＧＢＫＴ７－ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｍ－ＦＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡ转录激活活性检测ｐＧＢＫＴ７－ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｃ－ＦＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＧＣＧＧＣ转录激活活性检测３㊀第１２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀王文丽ꎬ等:玉米ＺｍＷＲＫＹ３６基因的生物信息学及功能分析２㊀结果与分析２.１㊀ＺｍＷＲＫＹ３６基因的克隆与鉴定特异性扩增产物经１.０％琼脂糖凝胶电泳分离ꎬ得到一条约１０００ｂｐ的特异性条带(图１)ꎮ测序结果显示ꎬ该基因序列包含一个完整的开放阅读框ꎬ长度为１００２ｂｐꎻ通过序列比对ꎬ发现其与ＭａｉｚｅＧＤＢ公布的序列完全一致ꎬ共编码３３３个氨基酸(图２)ꎬ证明成功克隆到ＺｍＷＲＫＹ３６基因ꎮ图１㊀ＺｍＷＲＫＹ３６基因的ＰＣＲ扩增图２㊀ＺｍＷＲＫＹ３６基因的开放阅读框和编码的氨基酸序列２.２㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的理化性质分析结果(表２)显示ꎬＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的分子量为３５.８ｋＤａꎬ分子式为Ｃ１５２７Ｈ２４２５Ｎ４６９Ｏ４９６Ｓ１７ꎻ由２０种常见的氨基酸组成ꎬ其中ꎬ含量最高的是甘氨酸(Ｇｌｙ)ꎬ含量为１２.３％ꎬ含量最低的是天冬酰胺(Ａｓｎ)和色氨酸(Ｔｒｐ)ꎬ均仅为０.６％ꎻ预测理论等电点为５.６６ꎬ小于７ꎬ为酸性蛋白ꎻ不稳定系数为６７.１６ꎬ属极不稳定蛋白ꎻ亲水指数为－０.５２６ꎬ是亲水性蛋白ꎮ㊀㊀表２㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的理化性质氨基酸个数分子量/ｋＤａ理论等电点不稳定系数脂肪系数亲水指数３３３３５.８５.６６６７.１６６５.１７－０.５２６４山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀２.３㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的二、三级结构预测二级结构预测结果表明ꎬＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的多肽链中无规则卷曲所占比例最高ꎬ为５３.４５％ꎻ其次为α－螺旋ꎬ占比３０.６３％ꎻ延伸链和β－折叠的含量较少ꎬ分别为１０.２１％和５.７１％ꎮ随后利用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ对ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白进行三维结构预测ꎬ模板覆盖率为３２.１５％ꎬ得到其三级结构ꎬ见图３ꎮ２.４㊀ＺｍＷＲＫＹ３６的系统进化分析和序列分析㊀如图４所示ꎬＺｍＷＲＫＹ３６与高粱的Ｓｂ￣ＷＲＫＹ６４㊁稷的ＰｍＷＲＫＹ４和狗尾草的ＳｖＷＲＫＹ４亲缘关系较近ꎮ进一步进行序列比对分析ꎬ结果(图５)表明ꎬＺｍＷＲＫＹ３６蛋白序列包含１个ＷＲＫＹ结构域(ＷＲＫＹＧＱＫ)和１个Ｃ２ＨＣ锌指结构基序(Ｃ－Ｘ７－Ｃ－Ｘ２３－Ｈ－Ｘ－Ｃ)ꎬ属于玉米ＷＲＫＹ转录因子Ⅲ类亚家族成员ꎮ图３㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的三级结构预测图４㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的系统进化树图５㊀ＺｍＷＲＫＹ３６与同源蛋白的氨基酸序列比对结果２.５㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的亚细胞定位亚细胞定位结果显示ꎬＺｍＷＲＫＹ３６蛋白仅定位在细胞核里(图６)ꎬ与核标记ｍＣｈｅｒｒｙ的亚细胞定位一致ꎻ而对照ＧＦＰ蛋白被发现定位于细胞膜㊁细胞质和细胞核中ꎮ表明ＺｍＷＲＫＹ３６是一个细胞核定位蛋白ꎮ５㊀第１２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀王文丽ꎬ等:玉米ＺｍＷＲＫＹ３６基因的生物信息学及功能分析图６㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的亚细胞定位２.６㊀转录激活活性分析为了检测ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白是否存在转录激活活性ꎬ将其全长编码序列(ＺｍＷＲＫＹ３６)㊁Ｎ端序列(ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｎ)㊁Ｎ端加中间序列(Ｚｍ￣ＷＲＫＹ３６－Ｎ＋Ｍ)㊁中间序列(ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｍ)以及Ｃ端序列(ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｃ)分别与载体ｐＧ￣ＢＫＴ７的ＧＡＬ４ＤＮＡ结构域结合并转入酵母中融合表达ꎮ结果(图７)发现ꎬ转化表达ＺｍＷＲＫＹ３６和ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｃ的酵母在筛选型培养基ＳＤ－Ａｄｅ－Ｈｉｓ－Ｔｒｐ上生长良好ꎬ并且在Ｘ－α－ｇａｌ测试中呈现蓝色ꎻ而转化表达对照空载体㊁ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｎ㊁ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｎ＋Ｍ以及ＺｍＷＲＫＹ３６－Ｍ的酵母图７㊀ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白的转录激活活性分析结果在筛选型培养基上则不能存活ꎮ表明Ｚｍ￣ＷＲＫＹ３６在酵母细胞内具有较强的转录激活活性ꎬ而且碳端序列是其发挥转录激活活性的功能区域ꎮ２.７㊀ＺｍＷＲＫＹ３６基因在玉米不同组织和不同胁迫处理下的表达分析利用ｑＲＴ－ＰＣＲ对ＺｍＷＲＫＹ３６基因在玉米植株中的表达模式进行分析ꎬ结果发现ꎬＺｍＷＲＫＹ３６在玉米叶和根中表达量较高ꎬ在花丝㊁花粉㊁茎㊁胚㊁果穗和胚乳中表达量较低(图８)ꎮ盐胁迫(２００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)和干旱胁迫(２０％ＰＥＧ６０００)均可显著诱导ＺｍＷＲＫＹ３６基因的表达ꎬ且表达量均在处理１ｈ最高ꎬ之后随处理时间延长逐渐下将ＺｍＷＲＫＹ３６在玉米茎中的表达量定义为１ꎬ用ｔ检测分析其他器官或组织中的表达量与之的差异ꎮ∗㊁∗∗㊁∗∗∗㊁∗∗∗∗分别表示与对照在０.０５㊁０.０１㊁０.００１㊁０.０００１水平上差异显著ꎬ下同ꎮ图８㊀ＺｍＷＲＫＹ３６基因在玉米不同器官或组织中的表达６山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀降(图９)ꎮ推测ＺｍＷＲＫＹ３６基因在玉米响应干旱胁迫和盐胁迫过程中可能扮演着正调控因子的角色ꎮ图９㊀干旱胁迫(Ａ)和盐胁迫(Ｂ)下ＺｍＷＲＫＹ３６基因表达量的变化动态３㊀讨论与结论玉米是全球第一大粮食作物ꎬ也是工业原料和动物饲料的重要来源ꎮ然而ꎬ玉米的生长发育及产量和质量常会遭受多种生物和非生物胁迫的影响ꎮＷＲＫＹ转录因子在植物生长发育㊁物质能量代谢及生物和非生物胁迫应答等过程中发挥着重要作用[２３－２４]ꎮ本研究以玉米自交系Ｂ７３为材料ꎬ克隆到一个ＷＲＫＹ转录因子基因Ｚｍ￣ＷＲＫＹ３６ꎬ其开放阅读框为１００２ｂｐꎬ编码３３３个氨基酸ꎻＺｍＷＲＫＹ３６蛋白分子量为３５.８ｋＤａꎬ是极不稳定的酸性亲水性蛋白ꎬ被定位在细胞核中ꎬ与ＳｂＷＲＫＹ６４㊁ＰｍＷＲＫＹ４和ＳｖＷＲＫＹ４同源关系较近ꎬ含有１个ＷＲＫＹ保守７肽结构和１个Ｃ２ＨＣ锌指结构基序ꎬ具有较强的转录激活活性ꎮ表达分析发现ꎬＺｍＷＲＫＹ３６基因表达具有明显的组织特异性ꎬ在玉米叶和根中表达量较高ꎬ而在果穗和胚乳中表达量低ꎻ干旱胁迫和盐胁迫均可显著诱导ＺｍＷＲＫＹ３６上调表达ꎬ且在处理１ｈ达到峰值ꎬ之后随胁迫处理时间延长而降低ꎮ因此ꎬ推测ＺｍＷＲＫＹ３６蛋白可能作为ＷＲＫＹ转录因子Ⅲ类亚家族的成员之一在玉米响应干旱或盐胁迫过程中发挥正调控作用ꎮ本研究结果可为深入探讨ＺｍＷＲＫＹ３６基因的生物学功能ꎬ揭示其调控玉米干旱胁迫和盐胁迫的分子机制提供参考ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＧｏｙａｌＰꎬＤｅｖｉＲꎬＶｅｒｍａＢꎬｅｔａｌ.ＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ￣ｔｏｒｓ:ｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬｒｅｇｕｌａｔｉｏｎꎬａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａꎬ２０２２ꎬ２６０(２):３３１－３４８.[２]㊀ＫｈｏｓｏＭＡꎬＨｕｓｓａｉｎＡꎬＲｉｔｏｎｇａＦＮꎬｅｔａｌ.ＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ(ＴＦｓ):ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｗｉｔｃｈｅｓｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄｒｏｕｇｈｔꎬｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬａｎｄｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｆｒｏｎｔ.ＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２０２２ꎬ１３:１０３９３２９.[３]㊀ＷａｎｉＳＨꎬＡｎａｎｄＳꎬＳｉｎｇｈＢꎬｅｔａｌ.ＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ￣ｔｏｒｓａｎｄｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ:ｌａｔｅｓｔｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｒｏｓｐｅｃｔｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ.ꎬ２０２１ꎬ４０(７):１０７１－１０８５.[４]㊀ＺｈａｎｇＹＪꎬＷａｎｇＬＪ.ＴｈｅＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｕｐｅｒ￣ｆａｍｉｌｙ:ｉｔｓｏｒｉｇｉｎｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｅｓａｎｄｅｘｐａｎｓｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＢＭＣＥｖｏｌ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２００５ꎬ５:１.[５]㊀ＪｉａｎｇＹꎬＤｕａｎＹꎬＹｉｎＪꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｏｐｕｌｕｓＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉ￣ｌｙａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｂｉｏｔｉｃａｎｄａｂｉ￣ｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２０１４ꎬ６５(２２):６６２９－６６４４.[６]㊀ＥｕｌｇｅｍＴꎬＲｕｓｈｔｏｎＰＪꎬＲｏｂａｔｚｅｋＳꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＷＲＫＹｓｕｐｅｒ￣ｆａｍｉｌｙｏｆｐｌａｎｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２０００ꎬ５(５):１９９－２０６.[７]㊀ＬｉａｎｇＱＹꎬＷｕＹＨꎬＷａｎｇＫꎬｅｔａｌ.ＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍＷＲＫＹｇｅｎｅＤｇＷＲＫＹ５ｅｎｈａｎｃｅｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ[Ｊ].Ｓｃｉ.Ｒｅｐ.ꎬ２０１７ꎬ７(１):４７９９.[８]㊀ＤａｉＷＳꎬＷａｎｇＭꎬＧｏｎｇＸＱꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＦｃＷＲＫＹ４０ｏｆＦｏｒｔｕｎｅｌｌａｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａｆｕｎｃｔｉｏｎｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｉｎｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｏｎｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓａｎｄｐｒｏｌｉｎｅｂｉ￣ｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳＯＳ２ａｎｄＰ５ＣＳ１ｈｏｍｏｌｏｇｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌ.ꎬ２０１８ꎬ２１９(３):９７２－９８９.[９]㊀ＧａｏＹꎬＬｕＹꎬＷｕＭＱꎬｅｔａｌ.ＡｂｉｌｉｔｙｔｏｒｅｍｏｖｅＮａ＋ａｎｄＲｅ￣ｔａｉｎＫ＋ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｗｏｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｓｅｅｄｌｉｎｇｓ[Ｊ].Ｆｒｏｎｔ.ＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２０１６ꎬ７:１７１６.[１０]ＺｈｕＤꎬＨｏｕＬＸꎬＸｉａｏＰＬꎬｅｔａｌ.ＶｖＷＲＫＹ３０ꎬａｇｒａｐｅＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｐｌａｙｓａｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｕｎ￣ｄｅｒｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２０１９ꎬ２８０:１３２－１４２.[１１]ＹａｎＨＲꎬＪｉａＨＨꎬＣｈｅｎＸＢꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｃｏｔｔｏｎＷＲＫＹｔｒａｎ￣ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＧｈＷＲＫＹ１７ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｔｈｒｏｕｇｈＡＢＡｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｔｈｅｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１４ꎬ５５(１２):２０６０－２０７６.７㊀第１２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀王文丽ꎬ等:玉米ＺｍＷＲＫＹ３６基因的生物信息学及功能分析[１２]ＦａｎｇＸꎬＬｉＷꎬＹｕａｎＨＴꎬｅｔａｌ.ＭｕｔａｔｉｏｎｏｆＺｍＷＲＫＹ８６ｃｏｎ￣ｆｅｒｓｅｎｈａｎｃｅｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２０２１ꎬ１６７:８４０－８５０.[１３]ＹａｎＺＷꎬＬｉｕＸꎬＬｊｕｎｇＫꎬｅｔａｌ.ＴｙｐｅＢｒｅｓｐｏｎｓｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｓａｃｔａｓｃｅｎｔｒａｌｉｎｔｅｇｒａｔｏｒｓｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅａｕｘｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｎｚｙｍｅＴＡＡ１[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ１７５(３):１４３８－１４５４.[１４]ＤｕｖａｕｄＳꎬＧａｂｅｌｌａＣꎬＬｉｓａｃｅｋＦꎬｅｔａｌ.ＥｘｐａｓｙꎬｔｈｅＳｗｉｓｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＲｅｓｏｕｒｃｅＰｏｒｔａｌꎬａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｂｙｉｔｓｕｓｅｒｓ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ.ꎬ２０２１ꎬ４９(Ｗ１):Ｗ２１６－Ｗ２２７. [１５]ＧｅｏｕｒｊｏｎＣꎬＤｅｌｅａｇｅＧ.ＳＯＰＭＡ:ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｂｙｃｏｎｓｅｎｓｕｓｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｆｒｏｍｍｕｌｔｉｐｌｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｃｏｍｐｕｔ.Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｓｃｉ.ꎬ１９９５ꎬ１１(６):６８１－６８４.[１６]ＧｕｅｘＮꎬＰｅｉｔｓｃｈＭＣ.ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬａｎｄｔｈｅＳｗｉｓｓ￣Ｐｄｂ￣Ｖｉｅｗｅｒ:ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｍｏｄｅｌｉｎｇ[Ｊ].Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎬ１９９７ꎬ１８(１５):２７１４－２７２３.[１７]ＳｏｈｐａｌＶＫꎬＤｅｙＡꎬＳｉｎｇｈＡ.ＭＥＧＡｂｉｏｃｅｎｔｒｉｃｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｂｉｏｉｎ￣ｆｏｒｍ.Ｒｅｓ.Ａｐｐｌ.ꎬ２０１０ꎬ６(３):２３０－２４０.[１８]ＧｕｏＸＰꎬＴａｎｇＹＭ.ＯＣＴ４ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｈｕｍａｎｌｅｕ￣ｋｅｍｉａｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｃｌｉｎ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.ꎬ２０１２ꎬ１２(４):２０７－２１６. [１９]ＨｕａｎｇＸＺꎬＨｏｕＬＹꎬＭｅｎｇＪＪꎬｅｔａｌ.ＴｈｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｏｎｏｆａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｅｄｉａｔｅｓｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｐｌａｎｔꎬ２０１８ꎬ１１(７):９７０－９８２.[２０]ＦｒｅｉＴꎬＣｅｌｌａＦꎬＴｅｄｅｓｃｈｉＦꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍｉｔｉ￣ｇａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｕｒｄｅｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２０２０ꎬ１１(１):４６４１.[２１]ＹｏｏＳＤꎬＣｈｏＹＨꎬＳｈｅｅｎＪ.Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｍｅｓｏｐｈｙｌｌｐｒｏｔｏ￣ｐｌａｓｔｓ:ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｃｅｌｌｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌ￣ｙｓｉｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｐｒｏｔｏｃ.ꎬ２００７ꎬ２(７):１５６５－１５７２.[２２]ＸｉａｎｇＹꎬＳｕｎＸＪꎬＢｉａｎＸＬꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＺｍＮＡＣ４９ｒｅｄｕｃｅｓｓｔｏｍａｔａｌｄｅｎｓｉｔｙａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｓｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒ￣ａｎｃｅｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２０２１ꎬ７２(４):１３９９－１４１０. [２３]ＣｈｅｎＬＧꎬＳｏｎｇＹꎬＬｉＳＪꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｐｌａｎｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃ￣ｔａꎬ２０１２ꎬ１８１９(２):１２０－１２８.[２４]ＨｕＷＪꎬＲｅｎＱＹꎬＣｈｅｎＹＬꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＷＲＫＹｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｍａｉｚｅｐｒｏｖｉｄｅｉｎ￣ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌ.ꎬ２０２１ꎬ２１(１):４２７.８山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。