白刺果实提取物的体外抑菌活性研究_张桂霞

ScienceandTechnologyofFoodIndustry研究与探讨2012年第13期[18]何会，宋哲，谢碧秀，等.荔枝皮花色苷体外抗氧化能力研究[J].食品科学，2009，30（11）：22-25.[19]单良，徐利萍，金青哲，等.黑芝麻黑色素的稳定性及自由基清除活性[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11527-11531.[20]霍婷，杨惠玲，薛文通，等.花生红衣色素的研究进展[J].食品工业科技，2008，29（11）：289-295.食品腐败变质是一个复杂的生物化学反应过程，涉及食品内物理、化学、酶、微生物等一系列反应，其中微生物的毒害最为严重。食品污染中主要的病原体包括埃希氏菌属的大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和杆菌。在延长食品保存期、保证食品品质的过程中，食品防腐剂具有非常重要的作用。目前常见食品防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钾等多由化学合成，而化学合成防腐剂大多具有潜在毒性，同时对自然界的生态环境也会造成不利影响。此外，微生物在不断的进化过程中多重耐药性的增强限制了合成药物的发展，同时也迫使我们寻求新的抗菌药物[1]。一般情况下，微生物的耐药性是可遗传的，因此寻求新的抗菌药物不应该再建立在合成药物的基础上，而天然产物成为最有效的来源[2]。尽管已经从浆果，如越橘、葡萄和沙棘籽的提取物中发现具有较高的抗菌活性物质[3-5]，但尚待开发的植物还很多，从自然界各类植物中发掘更高效、广谱、安全、稳定的天然防腐剂将对食品安全贮存有重要意义。白刺为蒺藜科落叶灌木。内蒙古分布有西伯利亚白刺、唐古特白刺、球果白刺和齿叶白刺4种[6]。白刺果实被美誉为“沙漠樱桃”，药食兼用，含有较丰富的维生素、氨基酸、多糖、红色素及其他生理活性物质[7]。本课题组研究发现，白刺果白刺果实提取物的体外抑菌活性研究张桂霞，齐敬浩，任旭，陈贵林*（内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010021）摘要：探讨白刺果实提取物的体外抑菌活性，以期为白刺果实的综合利用及天然食品防腐剂的开发提供依据。用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别对白刺果实95%乙醇提取物进行萃取，纸片法测定各萃取部分对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉、根霉和黑曲霉7种常见的食源性污染菌的抑菌效果，并通过倍比稀释法测定乙酸乙酯部分对其中3种细菌的最低抑菌浓度。结果表明：白刺果实乙酸乙酯部分、乙醇部分和氯仿部分对3种供试细菌均有抑菌作用，其中乙酸乙酯部分抑菌效果最好，且乙酸乙酯部分对3种细菌的抑制强弱顺序为：枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌；其中乙酸乙酯部分对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）均为25mg/mL，对大肠杆菌的MIC是50mg/mL。各萃取部分对供试真菌均无明显抑制作用。关键词：西伯利亚白刺，提取物，抑菌活性，最低抑菌浓度（MIC）InvitroantimicrobialactivityofextractsfromfruitsofNitrariasibiricapall.ZHANGGui-xia，QIJing-hao，RENXu，CHENGui-lin*（CollegeofLifeScience，InnerMongoliaUniversity，Hohhot010021，China）Abstract：EvaluatedtheinvitroantimicrobialactivityofNitrariasibiricaPall.FruitsextractstoprovidethebasisforutilizatingNitrariaresourcesanddevelopingnaturalfoodantiseptic.NitrariasibiricaPall.fruitswereextractedwith95%ethanol，thenfractionatedwithpetroleumether，chloroform，ethylacetateandn-butanolrespectively.Thefilterpaperdiscdiffusionmethodwasperformedtodeterminetheinfluenceofthedifferentextractsonthegrowthsof3bacterium（Escherichiacoli，Bacillussubtilis，Staphyloccocusaureus）and4fungus（Penicilliumsp.，Rhizopussp.，Aspergillusniger，Saccharomycescerevisiae），andtheminimalinhibitoryconcentrations（MICs）ofethylacetateextractsagaintsthe3kindsofbacteriumweretestedusingthedoublingdilutionmethod.Theresultsshowedthattheethylacetate，ethanolandchloroformextractshadantibacterialactivityagainstthe3kindsofbacterium.Inaddition，theethylacetateextractspresentedhigherantibacterialactivitythanothers.TheMICofethylacetateextractagainstEscherichiacoli，Bacillussubtilis，Staphyloccocusaureuswere25，25，50mg/mL.NoneoftheextractsexhibitedinhibitoryactivityagainstFungus.Keywords：NitrariasibiricaPall；extract；antimicrobialactivity；MIC中图分类号：TS201.2文献标识码：A文章编号：1002-0306（2012）13-0104-03收稿日期：2011－10－31*通讯联系人作者简介：张桂霞（1985-），女，硕士研究生，研究方向：药用植物化学。基金项目：国家科技支撑计划项目（2011BAI07B07）。!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!104DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.13.009研究与探讨2012年第13期Vol.33,No.13,2012

供试细菌抑菌圈直径（mm）乙醇提取物水相部分石油醚部分氯仿部分乙酸乙酯部分正丁醇部分乙酰螺旋霉素二甲基亚砜大肠杆菌（Escherichiacoli）8.27.07.07.010.17.014.77.0枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）7.77.07.07.011.47.335.27.0金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）7.57.07.09.48.97.015.17.0表1白刺果实提取物对供试细菌的抑菌活性Table1DiametersofinhibitionzoneofextractofN.sibiricafruitagainstbacteria实各提取部分具有较强的抗氧化活性，且乙酸乙酯部分抗氧化活性最强[8]。但是关于其抑菌活性的研究尚未见报道。本研究比较了白刺果实提取物不同萃取部分对7种常见的食品腐败菌的抑菌效果及最低抑菌浓度，以期为白刺果实的综合利用及天然食品防腐剂的开发提供依据。1材料与方法1.1材料与仪器西伯利亚白刺（NitrariasibiricaPall.）2010年7月16日于内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗独贵塔拉镇采集，经内蒙古大学生物系陈贵林教授鉴定为西伯利亚白刺，果实经阴干后，粉碎，过30目筛，待用；青霉（Penicilliumsp.）、根霉（Rhizopussp.）、黑曲霉（Aspergillusniger）、啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）以上菌种均由内蒙古大学生命科学学院微生物实验室提供；乙酰螺旋霉素赤峰蒙欣药业有限公司；苯甲酸国药集团化学试剂有限公司；其它化学试剂均为分析纯。BT124S、BT2202S型电子天平德国Startorius公司；Hei-VAP系列旋转蒸发仪德国TEGENT公司；KQ-250V型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；YXQ-LS-SⅡ型高压蒸汽灭菌锅上海博讯；SPX-150型数显生化培养箱宁波海曙赛福。1.2实验方法1.2.1白刺果实活性成分的提取取干燥粉碎的白刺果实240g，用95%的乙醇加热回流提取（料液比为1∶5，提取3次，分别提取2、1.5、1h），抽滤，真空旋转蒸发浓缩得95%乙醇提取物浸膏62.34g。将其分散于水中（1∶1.2），依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对95%乙醇提取物进行萃取，合并萃取液抽滤，真空旋转蒸发浓缩，得浸膏石油醚部分1.42g，氯仿部分1.35g，乙酸乙酯部分2.34g，正丁醇部分6.44g。1.2.2菌种活化及菌悬液的制备[9]取冷藏保存的上述供试菌，用接种环分别取少量菌落均匀的接种于相应斜面培养基上，放置生化培养箱中进行活化，扩大培养。细菌于37℃培养24h，真菌于28℃培养24h。将活化好的各种菌分别挑取一环制成初试菌悬液，10倍稀释法稀释后通过平板皿计数，确定菌液的稀释度，使菌悬液所含活菌量为1.0×108cfu/mL和1.0×106cfu/mL，备用。1.2.3培养基的制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养）：牛肉膏3g、NaCl5g、蛋白胨10g、琼脂粉20g，用蒸馏水定容于1000mL容量瓶中，pH调至7.2~7.4。马铃薯培养基（用于真菌培养）：鲜马铃薯200g、葡萄糖10g、琼脂粉20g，用蒸馏水定容于1000mL容量瓶中，pH自然。1.2.4抑菌实验———滤纸片扩散法白刺果实萃取部分的处理：用二甲基亚砜（DMSO）将白刺果实乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物、水相提取物充分溶解，配成浓度为80mg/mL的药液。阴性对照是DMSO；细菌实验阳性对照选用乙酰螺旋霉素，真菌阳性对照选用苯甲酸。抑菌圈直径测定：采用滤纸片扩散法[10]。用打孔器自制直径为7mm的滤纸。取经干热灭菌法灭菌的滤纸片，分别浸泡于各提取物所配的药液中2h，药液浓度80mg/mL，干燥。在无菌条件下，取1.0×108cfu/mL菌悬液100μL涂布在凝固的平板表面，再将滤纸片贴在表面含菌的平板上。细菌37℃倒置培养24h，真菌28℃倒置培养48h。培养结束后测量抑菌圈的大小，计算平均值。每组实验设3次重复。1.2.5最低抑菌浓度（MIC）———倍比稀释法[11]取抑菌效果最好的白刺果实萃取物部分，用DMSO溶解配成50mg/mL的药液，取样品溶液以相应体积的溶剂连续倍半稀释成样品浓度分别为50.0、25.0、12.5、6.3、3.2、1.6mg/mL的药液，取各药液1mL，分别加入1.0×106cfu/mL的3种细菌菌悬液10μL，混匀后取100μL菌药混合液均匀涂布3个平皿，同时用DMSO作阴性对照，乙酰螺旋霉素做阳性对照，37℃倒置培养24h。每组实验设3次重复。2结果与分析2.1白刺果实提取物各萃取部分对细菌的抑菌效果从表1可以看出，白刺果实不同萃取部分浓度为80mg/mL时，白刺果实乙醇萃取部分、乙酸乙酯萃取部分对3种供试细菌都有较好的抑菌效果。对不同萃取部分，乙酸乙酯萃取部分的抑菌能力要比乙醇萃取部分更明显；对不同供试菌，乙酸乙酯萃取部分对供试细菌的抑菌效果依次为：枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌。氯仿萃取部分对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，且抑菌能力大于乙酸乙酯部分。各提取部分对3种供试细菌的抑菌能力均小于同等浓度的乙酰螺旋霉素。2.2白刺果实提取物对真菌的抑菌效果本实验中我们还对白刺果实乙醇、水相、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取部分，浓度为80mg/mL时，对青霉（Penicilliumsp.）、根霉（Rhizopussp.）、黑曲霉（Aspergillusniger）和酵母（Saccharomycescervisiae）四种供试真菌进行了抑菌实验，研究结果发现各萃取部分均没有抑菌效果，说明白刺对供试真菌没有抑菌105