WB胶及试剂配制
- 格式：doc
- 大小：45.00 KB
- 文档页数：2
1.1 40% Bis-acrylamide with 2.6% C （Acrylamide:Bis, 38.95:1.05）
acrylamide 77.9g
Bis-acry 2.1g
Total 200ml
1.2 30%胶溶液:
Bis-acry 0.8g
acrylamide 29.2g
total 100ml
1.3 3M TrisHCl , pH 8.45
36.3g Trisbase
Total 100ml
1.4 WG ( water + Glycerol):
Water: 58ml
Glycerol: 36ml
Total: 94ml
1.5 10x Electrophoresis Buffer stock pH8.3
Trisbase 60.5g
Tricine 89.5g
SDS 5g
total 500ml
1.6 10% SDS
SDS 10g
Total 100ml
1.7 2x Laemmli Stacking Buffer pH6.8:
0.25M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS
total 500ml
1.8 transfer buffer
25mM Tris 3g
192mM glycine 14.4g
40% methanol 400ml
Total 1000ml
1.9 TBST
10mM Tris-HCl, pH7.4
100mM NaCl
0.2% Tween-20
Total 1000ml Separating gel： 15%
Separating Gel (15%) 1 gel
WG 1.88ml
40％ Gel.sol 2 ml
3M TrisHCl pH 8.45 2 ml
10% SDS 0.06 ml
10%APS 0.06 ml
TEMED 0.003 ml
Total 6.003 ml
Spacing gel： 10%
Spacer Gel (10%) 1 gel
dH2O 0.47 ml
30％ Gel.sol 0.5 ml
3M TrisHCl pH 8.45 0.5 ml
10% SDS 0.015 ml
10%APS 0.015 ml
TEMED 0.0015 ml
Total
1.5015 ml
Stacking gel：4%
Stacking Gel (4%) 1 gel
2×Stacking. buffer 1.5ml
30％ Gel.sol 0.75ml
ddH2O 0.75ml
TEMED 4ul
10%APS 40ul
Total 3.44ml
All recipes are designed for 1.5mm gel
1.1 做分离胶，加水封胶，待其凝固。
1.2 去除封胶水，做间隙胶，加水封胶，待其凝固。
1.3 去除封胶水，做浓缩胶，插梳子。
1.4 待浓缩胶凝固后，拔掉梳子，并将架子转移到电泳槽中，先在中部加入1x Electrophoresis
Buffer pH8.3，点样。
1.5 调节电压到60v,开始电泳，一小时后电压升至120v。
1.6 溴酚蓝开始跑出最下端时停止电泳
1.7 取胶，湿法转移，一张膜20v过夜，2张膜串联30v过夜
1.8 封闭45min，一抗37度孵育90min，然后洗涤5min*5次，2抗孵育 45min，洗涤8min*4次。曝光显影。
