过氧化氢酶活性的测定-紫外线吸收法

过氧化氢酶检测试剂盒（紫外法）过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外法)简介：过氧化氢酶(Catalase ，CAT)又称触酶，是一类以铁卟啉为辅基的结合酶，由四个相同亚单位组成的四聚体酶，共含4分子的亚铁血红素作为辅基，分子量约为24KD 。

CAT 能将细胞代谢产生的毒性物质过氧化氢迅速清除，可与GSH-Px 共同保护巯基酶、膜蛋白、过氧化氢解离。

Leagene 过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外法)其检测原理是血清或血浆等样品H 2O 2在240nm 处有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过H 2O 2，使待测溶液吸光度随反应时间而减少，通过紫外分光光度计检测240nm 处吸光度，根据测定吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

紫外法又称紫外分光光度计发或紫外吸收法，该酶的检测对于研究植物代谢强度及抗旱、抗病能力有一定的价值。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、配制CAT Assay buffer 工作液：按CAT Assay buffer(2.5×)：蒸馏水=1.5：1的比例稀释，即获得CAT Assay buffer 工作液，4℃预冷，待用。

2、配制100mM H 2O 2基液：本试剂盒提供的H 2O 2基液中的H 2O 2浓度约为1M 。

由于过氧化氢不是非常稳定，使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。

把浓度约为1M 的H 2O 2基液用CAT Assay buffer 工作液稀释100倍，使H 2O 2基液中的H 2O 2浓度约为10mM 。

3、准备样品：① 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行裂解，可以采用Leagene Western 及IP细胞裂解液。

如为植物样品或动物组织样品可按下列步骤操作。

a 、取植物样品0.4-0.5g 或动物组织样品，加入预冷的CAT Assay buffer 工作液2ml ，研磨匀浆，转移至15ml 离心管。

实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

一、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料马铃薯块茎。

（二）试剂1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。

2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

（三）仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。

三、实验步骤1 ．称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r ／ min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。

2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm下吸光度值，每隔 1min 读数一次。

四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。

也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

用常规法，即有机质用硫酸重铬酸钾外加热容量法， 三角瓶中、无基质对照加酸后过滤和无基质对照直接
碱解氮用碱解扩散法，速效磷用钼锑抗显色分光光度 过滤到盛有 5 ml 酸的三角瓶中。表 4 表明，硫酸加入
法，土壤 pH 用电位法 (水土比 2.5∶1)，阳离子交换量 顺序对溶液吸光度有显著影响。在加酸后过滤的条件
有效磷 Available P
(mg kg-1) 11.94 5.46 0.50 2.53
CEC pＨ (Cmol(+) kg-1)
5.58 12.34 5.76 10.73 4.47 15.72 4.20 27.42
1.2 所用试剂与仪器 （1）0.3%的 H2O2：取 30%的 H2O2 试剂稀释 100 倍
土壤酶活性是土壤生物活性和土壤生化反应强 度反映[1]，也是土壤肥力水平的反映，土壤中的生化反 应过程和养分形态的转化一般都是在土壤酶的参与 下进行的。土壤酶主要来源于土壤微生物的活动和植 物分泌物，土肥力水平[2]、土壤污染状况[3, 4]以及土壤对 环境变化的响应[5]都会影响土壤酶活性。通过分析土 壤酶活性可以评价土壤土壤微生物活性、生物化学反 应程度、土壤肥力水平和土壤污染状况。过氧化氢酶 是生物呼吸、生物代谢过程，以及土壤动物、植物根系 分泌及残体分解[6, 7]中的重要酶类，在生物体(包括土 壤)中，过氧化氢酶的作用在于破坏对生物体有毒的过 氧化氢[8]。因此无论研究土壤、植物，还是动物过氧化 氢酶都具有重要意义。一种快速、简便、准确测定过氧 化氢酶活性的方法无疑对过氧化氢酶的研究具有促 进作用。测定土壤过氧化氢酶活性主要是基于测定过 氧化氢与酶作用后释放出的氧和测定剩余的过氧化 氢两方面。利用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化 氢酶活性的方法目前尚未见报道。本试验探索一种利 用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化氢酶活性的 方法，本方法的成功将有助于土壤过氧化氢酶分析和 研究。

果蔬CAT过氧化氢酶测定方法过氧化氢酶是一种存在于许多生物体中的酶，能够将过氧化氢转化为水和氧气。

它在果蔬中的测定方法主要是通过检测其催化过氧化氢分解反应的速率来确定其活性水平。

下面将详细介绍果蔬CAT过氧化氢酶测定方法。

CAT活性的测定方法有许多种，比较常用的方法主要包括荧光法、吸收光谱法和高效液相色谱法。

这里将重点介绍吸收光谱法和高效液相色谱法。

吸收光谱法是通过测定CAT在特定波长的吸光度变化来计算其活性。

具体步骤如下：1.制备样品：将需要测定CAT活性的果蔬样品如苹果、西红柿等取样，剥去外皮并搅碎成泥状。

加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。

2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。

3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。

4.准备试剂：制备过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液，分别用于添加到样品中。

5.反应：将等量的样品、过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液混合，开始反应。

在特定波长下，间隔一段时间后，测量吸光度的变化。

6.计算活性：通过吸光度的变化计算出CAT的活性值，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。

高效液相色谱法也被广泛应用于CAT活性的测定。

具体步骤如下：1.制备样品：同样，将需要测定CAT活性的果蔬样品剥去外皮并搅碎成泥状。

加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。

2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。

3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。

4.蛋白质沉淀：将样品中的蛋白质沉淀出来，去除其他有干扰的物质。

5.准备色谱柱：将样品中的蛋白质溶液加入高效液相色谱仪的色谱柱中。

6.诱导反应：添加过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液到色谱柱中，开始诱导CAT的催化反应。

7.分离与检测：在高效液相色谱仪中，通过色谱柱对样品中的CAT和其他物质进行分离，并实时监测其峰值的变化。

8.计算活性：通过峰面积的计算，可以计算出CAT的活性，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。