过氧化氢酶活性的测定

过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。

【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。

【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。

( AS 1 + AS 2 ) 2
作
1.写实验报告 写实验报告 2.问题： 问题： 问题
业：
（1）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些 ）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? （2）过氧化氢酶与哪些生化过程有关 ）过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
操作步骤：
3．测定
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的 H2O2 ，每加完一管立即记时，并迅速倒入 石英测2min，记录数据。
4.按下式计算酶活性。
结果计算： 结果计算： 1min内 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 减少0.1的酶量为1个酶活单位（ 0.1的酶量为 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
A240 = AS0∆A240 × VT
0.1 × V 1 × t × FW
式中： 式中： 加入煮死酶液的对照管吸光值； AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； 加入煮死酶液的对照管吸光值 样品管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； 样品管吸光值 Vt—粗酶提取液总体积 ml）； 粗酶提取液总体积（ Vt 粗酶提取液总体积（ml）； 测定用粗酶液体积（ V1—测定用粗酶液体积（ml）； 测定用粗酶液体积 ml）； FW—样品鲜重 样品鲜重（ FW 样品鲜重（g）； 0.1—A 每下降0.1 个酶活单位（ 0.1为 0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； 加过氧化氢到最后一次读数时间（ t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 加过氧化氢到最后一次读数时间 min）。
操作步骤：
1 ． 称 取 植 物 材 料 0.3g ， 加 入 ， mo1 (pH7 0.1mo1/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.0) ml(分三次加入 分三次加入， 6ml( 分三次加入 ， 最后两次用于 洗研钵) 在研钵中研磨成匀浆， 洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆， 6000r 离心15 分钟， 15分钟 以 6000r ／ min 离心 15 分钟 ， 倾 出上清液。 出上清液。

【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定原理过氧化氢酶广泛存在于所有植物组织中。

它能将过氧化氢分解为氧气和水，保护生物体免受过氧化氢的毒性影响。

测定过氧化氢酶的方法包括测压法、滴定法和分光光度法。

氧电极法是一种灵敏、快速的氧释放速率测量方法。

氧释放速率与过氧化氢酶活性成正比。

仪器药品氧电极记录仪电磁搅拌器超级恒温水浴注射器、微量注射器和容量瓶反应杯亚硫酸钠过氧化氢酶50mmol/l磷酸缓冲液，ph7.0(见附表2)。

50mmol/L过氧化氢溶液：取30%过氧化氢1.4ml，用磷酸缓冲液稀释至250ml。

标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(sigma)1.0mg(110u/mg)，溶于50mmol/l磷酸缓冲液(ph7.0)11ml中，使酶浓度为10u/ml。

操作步骤1.仪器的标定按照实验步骤88校准仪器，以获得记录纸上每个小网格的等效氧含量。

2.绘制酶活性标准曲线（1）在反应杯中加入过氧化氢磷酸缓冲液，打开电磁搅拌器搅拌10分钟，插入电极，吸收电极外溢出的溶液，调整换档旋钮，使记录笔约满刻度的10-20%，使记录纸四处移动，温度在1-2分钟后达到平衡，记录笔画出一条直线。

(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110u/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。

（3）按照上述相同步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μL（例如，浓度为20、30、40、50U/ml），并记录氧释放曲线。

(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。

（5）以过氧化氢酶活性单位为横坐标，以每分钟释放的氧气量为纵坐标绘制标准曲线。

3.样品测定（1）将50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液注入反应室，搅拌10分钟，插入电极，记录10分钟后，以直线μL注入适当浓度的待测酶溶液样品，立即记录前90秒内的析氧曲线。

(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。

过氧化氢酶活力检测方法过氧化氢酶（catalase）是一种重要的酶类物质，它在生物体内起着催化无毒的氧化还原反应，将过氧化氢（H2O2）分解成水（H2O）和氧气（O2）。

由于其在维持细胞内氢离子浓度、氧化还原平衡和细胞抵抗氧化应激等方面的重要作用，因此过氧化氢酶活性的准确测定和分析显得非常必要。

在实验室中，常用的过氧化氢酶活力检测方法主要有光度法、气体检测法和电化学检测法。

首先是光度法，这是一种常用的测定过氧化氢酶活力的方法。

实验中，可以通过分光光度计测量酶样溶液中过氧化氢的浓度的变化来推测过氧化氢酶的活性。

具体的测定步骤一般为：首先，在酶样溶液中加入过氧化氢；然后，在适宜的温度下进行一段时间的潜伏期；然后，用过氧化氢检测试剂滴定到一定浓度时，观察溶液的颜色变化，并用分光光度计读取吸光度。

根据吸光度的变化可以计算出过氧化氢酶的活性。

第二种方法是气体检测法，这是一种基于检测氧气产生的方法。

实验中，可以将过氧化氢溶液加入酶样溶液中，然后用带有氧气传感器的电极测量氧气的产生速率和浓度。

根据氧气产生速率的变化可以推断过氧化氢酶的活性。

第三种方法是电化学检测法，这是一种基于电流变化的方法。

实验中，可以将过氧化氢溶液加入酶样溶液中，然后通过电极测量氧气的生成速率。

根据电流的变化可以计算出过氧化氢酶的活性。

除了以上的方法，还有其他一些比较新颖的方法用于测定过氧化氢酶活性。

例如，近年来，一些研究人员采用蛋白质组学和质谱分析等技术，通过检测酶样溶液中蛋白质的表达水平和酶活性的相关性，来推断过氧化氢酶的活性水平。

总结起来，测定过氧化氢酶活性的方法有光度法、气体检测法、电化学检测法等。

不同的方法有各自的优缺点，例如，光度法具有操作简单、成本低廉的特点，但可能受其他物质的干扰；气体检测法具有灵敏度高的特点，但需要专门的仪器和高昂的成本；电化学检测法具有快速、灵敏的特点，但需要较高的技术水平和仪器要求。

研究人员可以根据实际需求和条件选择合适的方法来测定过氧化氢酶的活性。

过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：过氧化氢酶活性测定实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。

即可求出消耗的H2O2的量。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。

（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。

三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。

CAT过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶（catalase，CAT）是一种常见的酶，广泛存在于细胞质和线粒体中，能够催化过氧化氢分解为氧气和水。

CAT活性的测定是评价细胞氧化应激和抗氧化能力的重要方法之一、本文将介绍两种常用的CAT活性测定方法：碘化钾法和比色法。

1.碘化钾法：碘化钾法是利用过氧化氢在碱性条件下与碘离子反应生成氧气，然后通过滴定测定碘化钾的消耗量，间接测定CAT活性。

实验步骤如下：1）制备适量的超纯水溶解适量的碘化钾，并与浓度为0.1M的Na2CO3缓冲溶液混合，调整pH至10-112）将待测样品加入上述溶液中，使得总体积约为2mL。

3）在和样品相同条件下作空白对照实验。

4）加入10%的H2O2溶液激活酶，使得最后的浓度约为0.1%。

5）停止反应，一般方法是加入0.1M的硫酸停止酶促反应，使得酶催化生成的氧气转化为水。

6）滴定反应液中的I2溶液，直至反应液呈深蓝色为止。

7）计算CAT活性，根据滴定的I2溶液量计算反应液中过氧化氢含量，再用过氧化氢摩尔浓度除以单位时间，得到CAT的活性。

2.比色法：比色法是通过测量酶催化H2O2分解时产生的物质的吸光度或荧光强度变化来间接测定CAT活性。

实验步骤如下：1）将待测样品加入适量的酶活化缓冲液中。

2）加入适量的过氧化氢（一般浓度为10mM）。

3）在和样品相同条件下作空白对照实验。

4）置于适当的反应温度下孵育一段时间。

5）停止反应，一般方法是加入NaOH溶液，将反应液pH调至碱性，停止酶促反应。

6）测定反应液中的吸光度或荧光强度。

7）根据标准曲线计算CAT活性，通过反应液的吸光度/荧光强度与CAT活性的关系曲线，计算待测样品中CAT的活性。

总结：CAT活性的测定方法主要有碘化钾法和比色法，两种方法均是通过间接测定过氧化氢酶催化反应产物氧气的生成量来计算CAT活性。

碘化钾法利用滴定I2溶液的消耗量计算CAT活性，而比色法则通过测定酶催化反应产物的吸光度或荧光强度来计算CAT活性。

A 空 10 5 白
B 反 10 应
55 - 1
分 钟
5
51
医学课件ppt
3
5 VA(空白)
=
VB(反应
35
液)
=
8
五、实验结果与计算：
1、被分解的H2O2量（mg） = （空白滴定值-样品滴定值）×Na2S2O3摩尔浓度×17
2、CAT活性（mg.g-1.min-1）= 被分解的H2O2量（mg）×(总体积÷测定取液量) 样品重（g）×时间（min）
H2O2（余）+2KI+H2SO4----→I2+K2SO4+2H2O
I2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠）
用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反应
液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出分
解的H2O2量。
医学课件ppt
5
三、实验材料、仪器和试剂：
医学课件ppt
6
四、实验步骤：
1、酶液提取：
称取0.5g三叶草，加少量石英砂，CaCO3，2ml水，研成匀浆， 移入50ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。
2、酶促反应：
（1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶 中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。
医学课件ppt
9
六、思考题：
1、本实验中影响CAT活性测定的因素有哪些？
医学课件ppt
10
记录两次消耗Na2S2O3的体积医VA学(课空件白p)p，t VB(反应液)。
7
酶活性测定
管 号
酶 液

过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶（catalase）是一种重要的酶类，在多种生物体和植物中广泛存在。

其主要作用是将氧化还原反应中产生的过氧化氢（H2O2）转化成水（H2O）和氧气（O2）。

这个反应是非常重要的，因为H2O2是一种有害物质，会破坏细胞内的蛋白质、脂质和DNA等结构。

因此，过氧化氢酶不仅保护生物体内部结构的完整性，还保护它免受外部环境的伤害。

本文将介绍过氧化氢酶活性的测定方法。

实验材料：1. 1.5 mL离心管；2. 10% 过氧化氢溶液；3. 100 mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）；4. 视网膜素（1 mg/mL）。

实验步骤：1. 将取自动物或植物的新鲜组织（例如肝脏、叶片、果实）切成小块，加入绞肉机中充分研磨，随后用冷水冲洗，挤出汁液，离心5分钟，去除颗粒，收集上清液作为酶提取物；2. 准备一组试管，分别加入0.1 mL酶提取物、0.5 mL100 mM磷酸缓冲液和0.4 mL 10% 过氧化氢溶液，并加入0.1 mL纯水作为对照试验管；3. 在试管中迅速混合，放在37℃恒温水浴中反应15分钟；4. 反应结束后，加入1 mL苯酚酐试剂，盖上盖子，轻轻颠倒，立即读取吸光度A405，并计算过氧化氢酶活性。

计算过氧化氢酶活性的公式为：过氧化氢酶活性（U/mg）= [（对照A405 - 试验A405）/ 对照A405] × 1000/ [反应体系总反应时间（分钟）÷ 酶提取体积（mL）] × 酶提取物的蛋白质浓度（mg/mL）其中，对照是不加入酶提取物的试验管，试验则是加入酶提取物的试验管。

以对照的A405为100%活性，试验管的活性则为相对活性。

过氧化氢酶的活性单位为U/mg，也可以表示为U/g或U/L。

本实验中，苯酚酐试剂可以与酶提取物中产生的H2O2发生氧化反应，形成深蓝色产物，进而测量吸光度，从而计算出过氧化氢酶的活性。

总之，本实验的目的是测定过氧化氢酶的活性，以此来了解生物体内的氧化还原反应是否正常，并研究它在细胞生物学中的作用。

实验九_过氧化氢酶(CAT)活性的测定一、实验目的1.了解过氧化氢酶的作用和测定方法。

二、实验原理过氧化氢酶(CAT)是一种广泛存在于生物体内的酶，其主要作用是催化过氧化氢(H2O2)分解为水(H2O)和氧(O2)，具有清除细胞内产生的过氧化氢的作用，从而保护细胞免受氧自由基的损伤。

测定过氧化氢酶活性的基本原理是利用过氧化氢酶催化过氧化氢分解的特性，测定其对过氧化氢的催化效率，从而求得过氧化氢酶的活性。

三、实验步骤1.将0.05 mL的0.1 mol/L H2O2加入到0.95 mL反应液中，混匀。

2.分别分装0.1 mL过氧化氢酶标准液A(1 U/mL)、待测样品液和纯水于三个小瓶中。

3.向3个小瓶中加入0.6 mL反应液，混匀后立即读取吸光度值。

4.将三个小瓶依次放入比色皿中，加入等体积的反应液，混匀。

5.在室温下，按照每分钟一次，共计计时5分钟，依次读取吸光度值。

6.根据吸光度值计算过氧化氢酶的活性。

四、实验注意事项1.使用新鲜的过氧化氢酶，避免长时间贮存或受热的过氧化氢酶，因其活性会降低。

2.必须按照比色皿上的顺序加入待测样品、过氧化氢酶标准液和纯水。

3.测定过氧化氢酶活性时，要注意比色皿内的反应物混匀程度和加液顺序。

4.读取吸光度时，要记录时间，使时间相同，以便计算活性值。

五、实验结果处理1.计算反应液的吸光度(OD)值。

2.计算酶活性的计算式为：CAT活性=(sample-Blank)/F/(T2-T1)其中，sample为待测样品的吸光度值；Blank为加入纯水的比色皿的吸光度值；F为稀释系数；T2-T1为反应时间，单位为分钟。

1.活性计算结果应该合理，符合实验要求。

2.实验结果能够表明过氧化氢酶的活性。

七、实验总结本次实验通过测定过氧化氢酶活性的方法，了解了测定过氧化氢酶活性的原理，熟悉了测定过氧化氢酶活性的步骤和操作方法。

同时，也掌握了计算过氧化氢酶活性的方法以及如何进行实验结果分析。

过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。

学习几种测定CAT活性的方法，理解其测定原理。

一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。

H202的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。

其原理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。

根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。

其反应为：H2O2十2KI十H2S04→I2十K2S04十2H20I2+2Na2S2O3→2NaI+NaS406二、材料、设备与试剂1．植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。

2．主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml 三角瓶。

3．试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml 浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。

(3)10％的钼酸铵溶液：称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。

(4)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl2防腐)。

(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取Na2S2O3·5H2O 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，加入约0.1gNa2CO3，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。

一天后进行标定。

标定方法：精确称取分析纯K2Cr207约0．15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解，加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr3+离子的颜色)为止。

三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：梭梭 2、仪器： (1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶 (4)移液管 (5)三角瓶(100ml) 3、试剂：
（1）0.05M H2O2 （3）1.8M H 2SO4 液 （5）10%（NH4)6Mo7O24 （7）CaCO3­，石英砂
（2）0.2M Na2S2O3 （4 ）1.5%淀粉溶 （6）20% KI
保 温
1.8M 20% 钼酸 淀粉 H2SO4 KI溶 铵溶 溶液 (ml) 液(ml) 液(滴) (滴)
0.2M Na2S2O3 溶液的 滴定量
A 空 白
10
5
5 5 分 钟
-
1
3
5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
VA(空白)
=
B 反 应
VB(反应
5 1 3 5
10
-
5
液)
=
五、实验结果与计算：
1、被分解的H2O2量（mg） = （空白滴定值-样品滴定值）×Na2S2O3摩尔浓度×17 2、CAT活性（mg.g-1.min-1）= 被分解的H2O2量（mg）×(总体积÷测定取液量) 样品重（g）×时间（min）
细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防
御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。
二、实验原理:
CAT活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示：
在一定条件下，CAT能把H2O2分解为H2O和O2。当CAT与H2O2反应一定 时间(t) 后，再用碘量法测定未分解的 H 2O 2，以钼酸铵作催化剂，H2 O2 与
总体 测定取 积 液量
50 50 50 50 50 50 50 10 10 10 10 10 10 10

过氧化氢酶的活性测定方法一：高锰酸钾滴定法1、实验目的：掌握高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶的活性的原理和方法。

2、实验内容：实验原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2。

即可求出消耗的H2O2的量。

试剂：10％H2SO4；0.2mol／L磷酸缓冲液pH7.8；0.02mol／L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，用0.1mol／L草酸溶液标定；0.1mol／L H2O2：市售30％H2O2大约等于17.6mol／L，取30％H2O2溶液5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.02molKMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定；0.1mol／L草酸：称取优级纯H2C2O2·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

操作步骤：3.1酶液提取：取高羊茅草叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000r／min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

3.2酶反应过程取50mL三角瓶4个(3个测定，1个对照)，测定瓶中加入酶液2.5mL，对照瓶中加入煮死酶液2.5mL，再加入2.5mL 0.1mol／L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10％H2SO4 2.5mL。

3.3标定用0.02mol／L KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色(在30s内不消失)为终点。

3.4结果计算酶活性用每克鲜重样品1Min内分解H2O2的毫克数表示：酶活(mg／g·min)＝（A-B）×V T×1.7FW×V1×t（3-2）式中:A:对照KMnO4滴定毫升数(mL)；B:酶反应后KMnO4滴定毫升数(mL)；V T:酶液总量(mL)；V1:反应所用酶液量(mL)；W:样品鲜重(g)；1.7:1mL 0.1mol／L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。

过氧化氢酶活性测定引言过氧化氢酶是一种广泛存在于生物体中的重要酶类。

它能够催化过氧化氢（H2O2）与还原物质反应，将H2O2分解成水和氧气。

过氧化氢酶在细胞中起着调节氧化应激及清除有害过氧化氢的作用。

因此，测定过氧化氢酶活性对于研究生物体的氧化应激反应以及评估细胞状态具有重要意义。

原理过氧化氢酶的活性可以通过测定其催化过氧化氢分解反应速率来确定。

本实验以庚酮过氧化物（DPI）为底物，通过酶反应将庚酮过氧化物氧化为二氧化碳和乙酰乙醛。

乙酰乙醛的生成量与过氧化氢酶的活性成正比。

实验中，首先准备一定浓度的庚酮过氧化物溶液，并将待测酶样品与庚酮过氧化物混合。

在特定条件下，观察反应体系中庚酮过氧化物的消耗程度。

通过测定庚酮过氧化物消耗量的变化，可以计算出过氧化氢酶的活性。

实验步骤1.准备实验所需试剂和仪器：庚酮过氧化物溶液、酶样品、缓冲溶液、试管、分光光度计等。

2.设置实验条件：温度、pH值等。

3.分别取适量的庚酮过氧化物溶液和酶样品，加入相应的缓冲溶液，混合均匀。

4.在一组对照实验中，将庚酮过氧化物溶液替换为缓冲溶液，以消除庚酮过氧化物自身的分解。

5.在指定的时间间隔内，从不同实验体系中取出一定量的反应液，用分光光度计测定庚酮过氧化物的吸光度。

6.计算不同时间点庚酮过氧化物消耗量的变化，并绘制庚酮过氧化物消耗曲线。

7.根据庚酮过氧化物的消耗速率计算过氧化氢酶的活性。

数据处理根据庚酮过氧化物的消耗曲线，可以确定反应速率。

通过比较对照组与实验组的反应速率，计算过氧化氢酶的活性。

过氧化氢酶的活性计算公式如下：活性（μmol/min/mg）= (△A/min * Vt) / (ε * d * Venz * t * Venz)其中，△A/min为每分钟庚酮过氧化物的吸光度变化量，Vt为总体系体积，ε为庚酮过氧化物的摩尔吸光系数，d为光程，Venz为酶样品的体积，t为反应时间。

结论通过测定过氧化氢酶的活性，可以评估生物体内的氧化应激程度以及细胞的状态。

植物生理学实验报告实验题目：过氧化氢酶活性的测定-紫外线吸收法姓名班级学号一、实验原理和目的H 2O2在240 nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性二、实验器具和步骤材料：海桐叶仪器与用具：紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；试剂:0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.0 、pH7.8 0.1mol/L H2O2步骤：1．称取植物材料0.3g，加入，0.1mo1/L磷酸缓冲液 (pH7.0) 6ml(分三次加入，最后两次用于洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆，以 6000r／min 离心15分钟，倾出上清液。

2.测定：取10ml试管2支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按下表顺序加入试剂。

管号S1S2(对照)粗酶液(ml)0.20.2（ph7.8PBS）pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5蒸馏水(ml) 1.0 1.03．测定: 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测2min，记录数据。

4.按下式计算酶活性。

结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= ΔA240* Vt/(0.1* t* FW *V1 )Vt—粗酶提取液总体积（ml）；—测定用粗酶液体积（ml）；V1FW—样品鲜重（g）；每下降0.1为1个酶活单位（u）；0.1—A240t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

三、实验数据和作业过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=(1.546-1.526)*6/(0.1*2*0.3*0.2)=10四、数据分析过氧化氢酶活性较低，可能是由于叶片采集时间过久。

三、试验材料、仪器和试剂：
1、试验材料：三叶草
2、仪器： (1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶
(4)移液管 (5)三角瓶(100ml)
3、试剂：
（1）0.05M H2O2 （3）1.8M H2SO4 （5）10%（NH4)6Mo7O24 （7）CaCO3，石英砂
（2）0.2M Na2S2O3 （4）1.5%淀粉溶液
二、试验原理:
➢ CAT活性大小以一定时间内分解旳H2O2量来表达： 在一定条件下，CAT能把H2O2分解为H2O和O2。当CAT与
H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解旳H2O2，以 钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代 硫酸钠滴定碘，反应式为：
H2O2（余）+2KI+H2SO4----→I2+K2SO4+2H2O I2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠） 用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总旳H2O2量)和反应 液(可求出未分解旳H2O2量)，再根据两者滴定值之差求出分 解旳H2O2量。
➢ 氢氧自由基（OH˙）是化学性质最活泼旳活性氧，能够直接 或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，而且有非 常高旳速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速 细胞旳衰老和解体。
➢ 过氧化氢酶(catalase；CAT)能够清除H2O2、分解氢氧自由 基，保护机体细胞稳定旳内环境及细胞旳正常生活，所以 CAT是植物体内主要旳酶促防御系统之一，其活性高下与植 物旳抗逆性亲密有关。
（6）20% KI
四、试验环节：
1、酶液提取：
称取0.5g三叶草，加少许石英砂，CaCO3，2ml水，研成匀浆， 移入50ml容量瓶，冲洗研钵多次，定容，静置，过滤。

过氧化氢酶活力的测定碘量法过氧化氢酶（catalase）是一种重要的酶类，它能催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气。

过氧化氢酶活力的测定是研究酶活性和酶功能的常用方法之一，其中碘量法是一种常见且简便的测定方法。

碘量法是通过测定过氧化氢酶活性对碘化钾溶液消耗的碘量来间接反映酶活力。

具体步骤如下：1. 实验前的准备准备好所需的试剂和仪器设备。

试剂包括：过氧化氢溶液、碘化钾溶液、淀粉溶液、酶提取液等。

仪器设备包括：移液管、比色皿、分光光度计等。

2. 样品制备将待测的样品加入适量的提取液中，研磨均匀，通过离心等手段将细胞碎片去除，得到酶提取液。

酶提取液中的过氧化氢酶即可用于后续的测定。

3. 碘化钾溶液的制备将一定浓度的碘化钾溶液配制好，一般浓度为0.1mol/L。

注意，碘化钾溶液需新鲜配制并保存在暗处，以免被光照射而分解。

4. 实验操作取一定体积的酶提取液，加入适量的过氧化氢溶液中，使其反应一段时间。

然后，加入适量的碘化钾溶液，停止反应。

接着，加入适量的淀粉溶液，使反应体系中出现蓝色。

5. 测定与计算将混合溶液转移至比色皿中，利用分光光度计测定其吸光度。

根据吸光度与碘量的比例关系，可以计算出碘化钾溶液中消耗的碘量。

而碘量与过氧化氢酶活性之间存在一定的定量关系，从而可以间接反映出过氧化氢酶的活力。

通过以上实验步骤，我们可以测定出过氧化氢酶活性的结果。

需要注意的是，在测定过程中要严格控制实验条件，如温度、pH值等，以保证实验结果的准确性和可靠性。

除了碘量法，还有其他方法可以测定过氧化氢酶活力，如比色法、荧光法等。

每种方法都有其适用的场景和优缺点，研究人员可以根据实际需要选择合适的方法进行测定。

碘量法是一种常用且简便的测定过氧化氢酶活力的方法。

通过测定碘化钾溶液中消耗的碘量，可以间接反映出过氧化氢酶的活力。

这一方法在生物化学和医学领域有着广泛的应用，对于研究酶的功能和活性具有重要意义。

酵母过氧化氢酶（CAT）的测定方法一、CAT提取1.准备材料、仪器及试剂材料：酵母：5g仪器：天平、电子天平研钵（1个），石英砂，玻璃匀浆器冰箱（1台）玻璃棒（1个）高速离心机离心管容量瓶(1000ml、100ml)量筒SephadexG-75柱试剂：Na2HPO4、NaH2PO4 (0.1M磷酸缓冲溶液（PBS）：PH=7.0 ，20ml)、 (NH4)2SO41.1 0.1M PBS配制母液的配制配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS），根据需要可配制不同浓度PBS。

0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml水；0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水（3）0.2mol/L pH5.7～8.0的PBS的配制如下：取n ml0.2mol/L的NaH2PO4和mml0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PBS.0.1MPBS配制0.1M PBS（PH=7.0）：取500ml0.2M PBS{38ml 0.2M NaH2PO4（ml）+62 ml 0.2M Na2HPO4（ml）}，加水稀释至1000ml即可。

2.CAT提取称取干酵母5g→研磨→加20 mL 0.1 mol/L (pH7.0 )磷酸盐缓冲液(PBS)→4℃下放置30 min→玻璃匀浆器研磨20 min(使酵母细胞充分破壁，释放出酶) →10000r/min(4℃)离心15 min→取上清液作为粗酶液(用于测定CAT活性，并用于进一步纯化)3.CAT的提纯以上的粗酶上清液中加人固体(NH4)2SO4，使其饱和度达到70%→4℃静置15 min→4℃用14 000 r/min离心15 min→取上清液→测定CAT活性→上清液中加人固体(NH4)2SO4，使其饱和度达到80% → 4℃静置15 min →14 000 r/min离心15 min→取沉淀→沉淀用1 mL 0.1 mol/L的PBS(pH7.0)溶解→测定CAT活性。