293T细胞转染

293t过表达蛋白

293T细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，广泛应用于生物学研究和生物技术领域。它来源于人胚肾组织中的上皮细胞，并经过对T抗原的转染而得名。293T细胞不仅具有良好的细胞生长特性，还能够高效地表达外源蛋白。本文将重点介绍293T细胞过表达蛋白的原理、方法及应用。

一、293T细胞的特点

293T细胞是一种非肿瘤性细胞系，具有良好的生长特性和较高的转染效率。相比于其他细胞系，293T细胞的细胞密度可以达到较高水平，细胞生长周期较短，易于培养和扩增。此外，293T细胞在转染外源DNA时表现出较高的转染效率，是进行蛋白过表达的理想细胞模型。

二、293T细胞过表达蛋白的原理

293T细胞过表达蛋白的原理是通过转染外源DNA进入293T细胞，使其在细胞内产生目标蛋白的大量表达。一般采用质粒转染的方法，将包含目标蛋白编码序列的质粒DNA导入到293T细胞中。293T细胞具有较高的转染效率，可以较快地将目标蛋白表达到较高水平。

三、293T细胞过表达蛋白的方法

1. 质粒转染法：将目标蛋白编码序列插入适当的质粒载体中，通过转染将质粒导入293T细胞中。转染后，通过培养293T细胞，利用细胞内的转录和翻译系统，使目标蛋白得以表达。

2. 病毒载体转染法：将目标蛋白编码序列插入适当的病毒载体中，然后将病毒载体转染至293T细胞中。病毒载体转染法可以提高目标蛋白的表达效率，并且可以选择适当的病毒载体来调控蛋白表达的时机和水平。

3. 电穿孔法：通过电脉冲的作用，使293T细胞膜发生临时的孔洞，使质粒DNA能够进入细胞内。电穿孔法是一种高效的转染方法，适用于293T细胞的质粒转染。

四、293T细胞过表达蛋白的应用

1. 功能研究：利用293T细胞过表达蛋白的方法，可以对目标蛋白的功能进行研究。通过过表达目标蛋白，可以观察其对细胞生长、分化、凋亡等生物学过程的影响，揭示其相关的分子机制。

2. 药物筛选：利用293T细胞过表达蛋白的方法，可以对药物的靶点进行筛选和验证。通过过表达目标蛋白，可以观察药物与目标蛋白的相互作用，评估药物的效果和毒副作用。

293T细胞的培养[1]

293T细胞的培养

293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。

293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。

传代方法为:

1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;

2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;

3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1

ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;

4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;

5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。

值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。合适的传代周期为2~3天。传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。

慢病毒（过表达）包装步骤

秦超

1. 转染

复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）

⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀

⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min

⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min

⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2. 收毒(36—48h)

收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.

⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3. 接毒

接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml

细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。

4. 检测及培养细胞系（48h)

如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系,可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。

细胞名称 293 和 293T

种属 人

组织来源 293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复

制起始点与启动子区的质粒可以复制。用Ca3(PO4)2转染效率可高达50%。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸

酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的

便捷方式。

形态特点 上皮细胞

致瘤性 +

产物或抗原 大T抗原

染色体核型 亚三倍体人细胞系。染色体众数为64，30%的细胞有64 条染色体。4.2%的细胞染色体数目更多。多数细胞

der(1)t(1;15) (q42;q13), der(19)t(3;19) (q12;q13), der(12)t(8;12) (q22;p13),还有四条标记染色体，

有的细胞另有5条标记染色体。der(1)与M8 (or Xq+)常常成对出现。N17 与 N22各有四条。值得注意的是

多数细胞有三条X染色体，两条Xq+，一条Xp+。

生长特性 粘附

文献评价 293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化细胞。[RF32725]

表达转染的腺病毒5的基因。[RF32725]

早期报道认为此细胞含有Ad 5基因组左端和右端[RF32764]，现已清楚仅含有左端序列。[RF50113]

此细胞系人腺病毒滴度高。

室温不贴壁，37℃几日后重新贴壁。

表达由整合素beta-1 亚基与玻基结合素受体 alpha-v 亚基组成的玻基结合素细胞表面受体. [RF33793]

The Ad5 insert was cloned and sequenced, and it was determined that a colinearseqment from nts 1

to 4344 is integrated into chromosome 19 (19q13.2).