大肠菌群计数作业指导书

食品厂微生物沉降涂抹作业指导书微生物沉降涂抹作业指导书01参考标准：GBT 16294-2023 医药工业干净室（区）沉降菌的测试方法GB 15979-2023 一次性使用卫生用品卫生标准02涂抹操作（菌落总数、大肠菌群）：2.1 配制药品：生理盐水（试管中+棉签）或直接选购无菌涂抹棒、PCA、VRBA2.2 培育基灭菌：PCA------121℃，15分钟；VRBA------无需灭菌，煮沸即可，生理盐水------121℃，15分钟注：灭菌后的生理盐水需冷却彻底后才可以进行涂抹操作2.3 涂抹操作：2.3.1 取待测物（人员手部、操作案板、工器具表面等）涂抹面积为5*5cm2；2.3.2 涂抹后将与手部接触的棉签棒的部分折掉；2.3.3 检样作出2~3个稀释度：1mL（原液）无菌平皿中（10-1），2板菌落，2板大肠=4板9mL灭菌生理盐水中（10-2），2板菌落，2板大肠=4板于10-2试管中吸取1mL，加入9mL灭菌生理盐水中（10-3），2板菌落，2板大肠=4板注：菌落倒入配置后灭菌的PCA，15~20mL，大肠倒入配制后灭菌的VRBA，15~20mL2.3.4 培育：待琼脂凝固后放入培育箱中，平皿倒置（除霉菌PDA外，其余平皿均倒置培育），361℃，大肠培育24小时，菌落培育48小时。

2.3.5 查板计数：于N+1天，查大肠结果，N+2天，查菌落结果。

03沉降菌（菌落总数、霉菌）3.1 配制培育基：PCA、PDA；3.2 倒板：根据方案沉降点数，计算所需培育基及倒板的数量，PCA约20mL/板，PDA不得少于20mL/板（培育时间长，琼脂少就干巴了）；3.3 沉降：车间在30m2以上者，于东、西、南、北（距墙1m 处）、中五点；小于30m2者，于一条对角线里、中、外三点，高度均在1.5m处采样，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min（操作时，四周不得有人员走动，防止结果不准）；3.4 收板：将手部用75%酒精消毒后再收板，切忌触遇到平板内琼脂3.5 培育：PCA,361℃,培育48小时;PDA,28℃,培育5天；3.6 查板计数：于N+2天，查菌落结果，N+5天，查霉菌结果。

食品中大肠菌群平板计数检验原始记录表
样品名称
样品编号
检验项目
大肠菌群平板计数法
检验日期
检验地点
□BSL-2实验室
□洁实验净室
检验依据
判定依据
检验仪器
□生化培养箱□均质器□菌落计数仪
□生物安全柜□超净台□电子天平
□恒温振荡器□冰 箱□冰 箱
检验试剂
VRBA琼脂、BGLB肉汤、磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水等。
h
稀释度
空白
2
25g(mL)样品+225mL稀释液均质（或原液直接检验）；
平板A1
平板A2
3
10倍系列稀释；
结果
平板B1
4
选2-3个适宜稀释度样品匀液；每梯度接种VRBA平板2个；
平板B2
结果
5
36±1℃，18-24h培养，计数典型和可疑菌落；
平板C1
平板C2
6
挑10个可疑菌落接种于BGLB肉汤管36±1℃，24-48h；
结果
平板D1
7
若BGLB肉汤管产气则阳性；
平板D2
结果
8
按比例记录结果，报告。
平板E1
平板E2
温度（℃）
相对湿度（％RH）
结果
证实实验比例
结果
报告
检验员： 审Βιβλιοθήκη 员：样品制备□固体和半固体样品：无菌称取25g，置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水的无菌灭菌袋内，进行均质处理。
□液体样品：吸取25mL于样品于225mL磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水中，混匀。
检验程序
大肠菌群计数[ CFU/g (mL ) ]
1
实验采集抽样方案来自GB4789.1；

gb7101标准中大肠菌群标准1目的规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。

2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。

4责任质量部组织制订、化验室负责实施。

5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。

5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。

5.1.4 天平：感量0.1 g。

5.1.5 均质器。

5.1.6 振荡器。

5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。

5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。

5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

5.1.11 菌落计数器。

5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。

5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。

5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。

5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。

5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。

5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。

5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。

5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

菌落总数一、依据：GB 4789.2—2010二、目的：食品中菌落总数的测定三、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1恒温培养箱：（36 ±1）℃2恒温水浴箱：（46 ±1）℃。

3天平：感量为0.1 g、振荡器。

4无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

5无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL、无菌培养皿：直径90 mm。

6pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

7放大镜或/和菌落计数器。

四、培养基和试剂1平板计数琼脂培养基2磷酸盐缓冲液3无菌生理盐水五、检验步骤1称取25 g 样品置盛有225 mL 生理盐水的无菌捣碎机杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。

2用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

3按5.2 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。

4根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液在进行10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

5及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（46 ±1）℃倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

6待琼脂凝固后，将平板翻转，（36±1）℃培养48 h±2 h。

六、菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。