河南农业科学,2020,49(4):131-137Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2020.04.019收稿日期:2019-10-22基金项目:河南省科技攻关计划项目(172102110133);郑州市智汇郑州㊃1125聚才计划项目作者简介:陈玉梅(1982-),女,河南南阳人,讲师,博士,主要从事动物疫病免疫机制与疫苗研究㊂E -mail:yumeichen2012@通信作者:刘运超(1982-),男,河南周口人,副研究员,博士,主要从事动物疫病免疫机制与疫苗研究㊂E -mail:yunchaoliu2012@猪细小病毒病毒样颗粒的制备及其免疫评价陈玉梅1,周景明1,刘东民2,马丽萍1,冯㊀景2,刘运超2(1.郑州大学生命科学学院,河南郑州450001;2.河南中泽生物工程有限公司,河南郑州450000)摘要:为了研制猪细小病毒(Porcine parvovirus ,PPV )病毒样颗粒(Virus-like particles ,VLPs )疫苗,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化,合成猪细小病毒VP2蛋白编码区序列,并将其插入原核表达载体pET28a 中,随后转化BL21(DE3)感受态细胞,再转入伴侣蛋白质粒pTf16构建共表达载体,优化诱导表达条件,进行SDS -PAGE 及Western blot 鉴定㊂结果表明,在L -阿拉伯糖质量浓度为2mg /mL ㊁IPTG 浓度为0.1mmol /L ㊁温度为30ħ㊁诱导12h 时重组蛋白VP2可溶性表达量最高,经硫酸铵沉淀和Ni -NTA 亲和层析纯化获得纯度约90%的VP2蛋白,体外装配可形成直径约20nm 的具有血凝活性的VLPs ㊂用制备的VLPs 免疫昆明鼠并对其进行免疫评价,结果表明,制备的VLPs 能有效刺激机体产生高滴度抗体,ELISA 效价高达1ʒ25600㊂可见,制备的VLPs 能刺激机体产生特异性抗体㊂关键词:猪细小病毒;VP2蛋白;病毒样颗粒;疫苗;免疫评价中图分类号:S855.3㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)04-0131-07Preparation of Porcine Parvovirus Virus-like Particlesand Its Immunization EvaluationCHEN Yumei 1,ZHOU Jingming 1,LIU Dongmin 2,MA Liping 1,FENG Jing 2,LIU Yunchao 2(1.School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;2.Henan Zhongze Bioengineering Co.,Ltd.,Zhengzhou 450000,China)Abstract :In order to develop porcine parvovirus (PPV)virus-like particles (VLPs)vaccine,the VP2gene of PPV was optimized according to the preference codon usage of Escherichia coli (E.coli )andsynthesized.Subsequently,the synthesized VP2gene was subcloned into pET28a and transformed intoBL21(DE3),then the partner protein plasmid,pTf16,was transformed into the BL21(DE3)competent cell containing pET28a-VP2.The objective gene was induced by L-arabinose and IPTG,its product was identified by SDS-PAGE and Western blot,and then the optimization of expressed condition,anddistribution analysis of objective protein were done.The results indicated that,the expression quantity of soluble recombinant VP2protein was highest after induced by 2mg /mL L-arabinose and 0.1mmol /L IPTG at 30ħfor 12h.The recombinant VP2protein was purified by ammonium sulfate precipitation andNi-NTA affinity chromatography,and the purity was about 90%.The VLPs about 20nm were obtained,which could hemagglutinate red blood cell.And then Kunming mice were immunized with purified VLPs.The results showed that the prepared VLPs vaccine could effectively stimulate the body to produce hightiter antibodies(the titer of antibodies was up to 1ʒ25600by ELISA).Preliminary results showed that the河南农业科学第49卷prepared VLPs vaccine could stimulate body to produce specific antibody.Key words:Porcine parvovirus;VP2protein;Virus-like particles;Vaccine;Immunization evaluation㊀㊀猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)为无囊膜的单链线状DNA病毒,二十面体等轴立体对称结构(T=1),病毒粒子呈六角形或圆形,平均直径20~ 26nm,分子质量为5.3ˑ106u,主要引起母猪的繁殖障碍,导致怀孕母猪的死胎和木乃伊胎㊁断奶仔猪多系统衰弱综合征等[1-2]㊂PPV在我国流行极为广泛,猪场检测病毒阳性率极高,给养猪业造成巨大的经济损失[3]㊂PPV基因组包括2个开放阅读框(Open reading frame,ORF),ORF1编码非结构蛋白NS1㊁NS2和NS3;ORF2主要编码3种结构蛋白VP1㊁VP2和VP3,它们的分子质量依次是83ku㊁64ku和60ku[4-6]㊂VP1和VP2是从一组嵌套的编码序列中翻译出来的,较小的VP2是从与较大的VP1相同的RNA模板中剪接产生的,只是它们的氨基末端不同,而VP3是VP2的翻译后修饰产物㊂VP1蛋白大约占病毒粒子10%,主要在病毒复制和感染细胞时发挥作用,VP2蛋白是PPV的主要结构蛋白,约占病毒衣壳蛋白总量的60%以上,包含PPV主要的B细胞和T细胞抗原表位[7]㊂目前,接种PPV疫苗仍是预防猪细小病毒感染的主要手段之一[8]㊂PPV疫苗的发展经历了弱毒苗到灭活苗的过程,出于对疫苗本身安全性的考虑,弱毒疫苗的毒株和灭活疫苗的灭活手段也在不断改进,但是弱毒疫苗毒力返强和灭活疫苗灭活失败的危险,始终是困扰现有PPV疫苗防治策略的一个重要问题[7]㊂同时,长期㊁大剂量㊁多频次PPV疫苗免疫给猪场的生产带来很大的经济和劳动量负担㊂通过系统研究野外分离株中VP蛋白的遗传多样性,发现了PPV新的变异株,传统的PPV疫苗株的抗血清不能有效中和这些病毒[9]㊂PPV的变异给猪场PPV的防控带来新的压力,而一种安全㊁高效的疫苗对PPV的清除工作尤其关键㊂重组表达的VP2蛋白能自我装配成病毒样颗粒(Virus-like parti-cles,VLPs),是良好的抗原转运载体,并且能刺激机体产生中和抗体,因此,VP2蛋白对研究PPV疫苗具有很高的价值[6-7]㊂ANTONIS等[10]将PPV VP2基因成功克隆至杆状病毒表达系统,并在体外成功获得PPV VLPs,其免疫豚鼠和猪均能产生免疫保护反应㊂另外,国内外多个研究机构采用杆状病毒表达系统制备了VLPs,且该VLPs能够保护豚鼠抵抗PPV感染[11-15]㊂可见,PPV VP2在真核表达系统中能够顺利地形成VLPs结构,但是表达量较低,难以产业化应用㊂而采用原核表达系统表达VP2量较高,却难以实现可溶性表达,更难于形成VLPs 结构㊂目前在原核表达系统中获得高活性的PPV VP2蛋白仍然是一个重大挑战,司艳红等[16]将PPV VP2基因克隆到pET32a上,在E.coli中成功表达了以包涵体形式存在的VP2与Trx-His-tag的融合蛋白,经复性处理后未能得到VLPs㊂鉴于此,采用改进的大肠杆菌表达系统体外表达获得可溶性PPV VP2蛋白,经体外装配形成VLPs,通过进一步研究VLPs疫苗刺激昆明鼠产生免疫应答效果,分析VLPs刺激机体产生特异性抗体㊁血凝抑制抗体及中和抗体的情况,比较PPV VLPs疫苗与商品化灭活疫苗的免疫效果,为PPV VLPs疫苗的研制奠定基础㊂1㊀材料和方法1.1㊀载体㊁细胞㊁病毒及供试动物pET28a等质粒和菌种均由郑州大学生命科学学院抗体工程与分子免疫学实验室保存㊂伴侣蛋白Tf16表达质粒购自TaKaRa公司㊂PK-15细胞及PPV-7909标准毒株由郑州大学生命科学学院抗体工程与分子免疫学实验室培养并保存㊂供试动物:20只4周龄健康雌性昆明鼠购买自河南省郑州市实验动物中心㊂1.2㊀试剂Prime STAR Max DNA Polymerase㊁Bam HⅠ㊁XhoⅠ㊁T4DNA Ligase等分子生物学试剂均购自TaKaRa公司;Anti-6ˑHis-tag antibody购自Proteintech公司; HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abcam公司;IPTG㊁卡那霉素(Kan)㊁氯霉素(Cm)㊁L-阿拉伯糖等试剂均购自索莱宝科技有限公司;Ni-NTA亲和层析填料(Ni2+柱)购自Norvagen公司;Universal DNA回收试剂盒㊁质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司;BCA蛋白质浓度测定试剂盒购自Thermo公司;胰酶㊁FBS购自Gibco公司,弗氏完全/不完全佐剂购自Sigma公司㊂1.3㊀PPV VP2原核表达载体的构建以PPV的疫苗株WH-1株为研究对象,在GenBank中查询PPV VP2蛋白序列(China株,231㊀第4期陈玉梅等:猪细小病毒病毒样颗粒的制备及其免疫评价AY5883318),分析PPV VP2的基因和氨基酸序列,按照大肠杆菌密码子偏爱性,同时兼顾GC含量㊁mRNA的二级结构㊁核糖体结合位点和chi位点㊁限制性酶切位点等信息,优化并合成PPV VP2蛋白的基因㊂设计1对特异性引物,F:GGATCCATGTCG-GAAAATGTGGAACA(Bam HⅠ)㊂R:CCTCGAGTTA-ATACAGTTTCCGTGGAATGA(XhoⅠ)㊂将优化合成的PPV VP2基因经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后亚克隆至原核表达载体pET28a中,经菌液PCR㊁双酶切鉴定后送样测序,测序结果用DNAStar软件进行分析㊂将测序正确的阳性质粒转化E.coli BL21 (DE3)感受态细胞,用于重组蛋白表达㊂1.4㊀分子伴侣共表达菌株的构建将含有阳性重组载体pET28a-VP2的BL21菌株制成感受态细胞,将伴侣蛋白质粒pTf16转化上述感受态细胞,涂布含Kan+/Cm+双抗性的固体LB 培养基上,倒置37ħ恒温过夜㊂挑选6个单克隆接种于含Kan+/Cm+双抗性液体LB培养基中,37ħ220r/min振荡培养过夜,筛选共表达阳性转化子㊂1.5㊀重组蛋白初步表达与可溶性分析分别将含pTf16与不含pTf16的pET28a-VP2表达菌体按1ʒ1000比例接种于Kan+/Cm+LB培养液中,37ħ㊁220r/min过夜培养活化,将活化菌体按1ʒ100比例接种于含Kan+/Cm+双抗性的LB培养液中,37ħ㊁220r/min培养2h㊂当OD600为0.6~0.8,将含pTf16质粒的pET28a-VP2表达菌中加入终质量浓度为2mg/mL的L-阿拉伯糖和0.5mmol/L的IPTG,37ħ㊁220r/min振荡培养过夜;不含pTf16的表达菌只加入IPTG进行诱导㊂收集诱导后菌体并分别进行超声破碎,SDS-PAGE及Western blot分析表达产物㊂1.6㊀重组蛋白表达条件优化分别从诱导温度㊁诱导时间㊁IPTG浓度㊁质量浓度等方面进行了优化,诱导温度分别设为16㊁25㊁30㊁37ħ,0.5mmol/L IPTG诱导表达10h;IPTG浓度分别选择0.1㊁0.3㊁0.5㊁0.7㊁1.0mmol/L5个梯度(在最佳温度条件下诱导8h筛选);共设置6㊁12㊁16㊁20h4个诱导时间收获菌体(在IPTG浓度为0.5mmol/L㊁最佳温度下诱导)㊂分别用12%分离凝胶进行SDS-PAGE鉴定,以确定重组蛋白的最佳诱导表达条件㊂1.7㊀重组表达蛋白的纯化样品前处理:收集诱导表达菌体,用pH值8.0的50mmol/L Tris-HCl㊁300mmol/L NaCl缓冲液重悬后,进行超声破碎,12000r/min离心30min,取超声上清用于纯化;分别用20%㊁30%㊁40%及50%的(NH4)2SO4沉淀对表达的重组PPV VP2蛋白进行粗纯,经SDS-PAGE分析粗纯效果;经透析除去(NH4)2SO4,再选用Ni2+柱进行亲和层析纯化,采用咪唑浓度梯度洗脱法,用SDS-PAGE㊁Western blot检测重组蛋白纯度,BCA法测定重组蛋白含量㊂1.8㊀PPV VLPs组装及检测1.8.1㊀组装㊀在获得高纯度PPV VP2蛋白的基础上优化VLPs装配缓冲液条件,研究VP2蛋白在体外组装成VLPs的条件,用pH值8.0的50mmol/L Tris-HCl作为基础缓冲液,分别选择NaCl浓度为50㊁100㊁150㊁200㊁250mmol/L5个梯度,探讨盐离子浓度对VLPs结构组装效率㊁稳定性的影响㊂1.8.2㊀形成情况检测㊀通过透射扫描电镜(TEM)以及动态光散射技术(DLS)观察VLPs形成情况㊂1.8.3㊀血凝活性检测㊀采用血凝试验测定VLPs 的血凝活性,取96孔V型板,每孔加入PBS25μL,将VLPs进行系列倍比稀释,至11孔后吸取25μL 弃去,第12孔为PBS对照组,稀释后每孔再加入PBS25μL,最后每孔加入25μL1%小鼠红细胞悬液,微量振荡器轻微振荡摇匀,置于室温(20~25ħ),静止1h后判定结果,以能使100%红细胞凝集的VLPs最高稀释倍数作为判定终点㊂1.9㊀VLPs的免疫评价1.9.1㊀免疫程序㊀选取20只健康的昆明鼠随机分成4组,每组5只:A组免疫30μg VLPs;B组免疫15μg VLPs;C组免疫PPV灭活苗100μL;D组为PBS对照组,免疫100μL PBS㊂与佐剂分别配比后乳化免疫鼠(皮下多点注射),首免用弗氏完全佐剂,加强免疫选用弗氏不完全佐剂,首免后14d加强免疫一次㊂免疫后0㊁7㊁14㊁21㊁28㊁35㊁42㊁49㊁56d 断尾采血收集血清,采用ELISA㊁血凝抑制试验(HI)和病毒中和试验(VN)检测小鼠的抗体应答情况㊂1.9.2㊀ELISA测定抗体效价㊀用碳酸盐缓冲液(CBS)将纯化的VLPs稀释成2μg/mL,按50μL/孔的量加入96孔ELISA板内,4ħ包被过夜;PBST 洗3次,含5%脱脂奶粉的封闭液37ħ封闭2h; PBST洗3次,一抗用待检血清,以1ʒ100开始按2倍倍比稀释(1ʒ100㊁1ʒ200 1ʒ102400),二抗用HRP标记的羊抗鼠IgG(1ʒ5000),测定抗体效价㊂1.9.3㊀HI检测㊀配制4个100%血凝单位(即4HA100)331河南农业科学第49卷VLPs 与倍比稀释的待检血清(1ʒ100㊁1ʒ200 1ʒ102400)等体积混匀,每孔50μL 加入96孔血凝板,再加入50μL 1%小鼠红细胞悬液,摇匀,室温放置1h;判定结果:HI 效价即为完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度㊂1.9.4㊀病毒中和试验㊀提前将PK15细胞接种于96孔培养板中;随即稀释PPV 悬液至200个TCID 50;将待检血清每孔按50μL 在新的96孔板上做2倍连续倍比稀释(1ʒ10㊁1ʒ20 1ʒ5120),随后与稀释好的病毒悬液1ʒ1混合,放置1h;将病毒与血清混合液感染PK15细胞;观察细胞病变情况,计算血清的中和抗体效价㊂2㊀结果与分析2.1㊀PPV VP2蛋白原核表达载体的构建及重组蛋白的表达分析以优化合成的VP2基因为模板,应用高保真预混酶Prime STAR Max DNA Polymerase 对VP2序列进行扩增,将其插入pET28a 载体构建重组表达载体pET28a -VP2,并转化DH5α感受态细胞;经菌液PCR㊁双酶切鉴定及测序证实后的阳性质粒转化BL21(DE3)并制成感受态细胞,将伴侣蛋白质粒pTf16转化上述感受态细胞,涂布于含Kan +/Cm +双抗性固体LB 培养基上,37ħ倒置培养过夜㊂挑选6个单克隆于Kan +/Cm +双抗LB 液体培养基中,37ħ㊁220r /min 振荡培养筛选共表达阳性转化子㊂共表达菌经IPTG 及L -阿拉伯糖初步诱导后,收集菌体经超声破碎后用SDS -PAGE 及Western blot 进行检测,结果显示,在可溶性上清和沉淀中均检测到大小约64ku 的目的蛋白(图1A),当与伴侣蛋白Tf16共表达时,VP2蛋白的可溶性表达量明显增加(图1B),其中图1B 中第3孔在约56ku 位置的蛋白是伴侣蛋白Tf16㊂A:pET28a -VP2表达的SDS -PAGE 及Western blot 鉴定㊂M.Marker;1.超声上清;2.超声沉淀㊂B:共表达载体的SDS -PAGE 鉴定㊂M.Marker;1.pET28a -VP2上清;2.pET28a -VP2沉淀;3.pET28a -VP2与Tf16共表达上清;4.pET28a -VP2与Tf16共表达沉淀A.Identification of pET28a-VP2by SDS-PAGE and Western blot.M.Marker;1.Ultrasonic supernatant;2.Ultrasonic precipitation.B.Identification of co-expression products by SDS-PAGE.M.Marker;1.Supernatant of pET28a-VP2;2.Precipitation of pET28a-VP2;3.Supernatant of pET28a-VP2and Tf16co-expression;4.Precipitation of pET28a-VP2and Tf16co-expression图1㊀重组VP2蛋白的SDS -PAGE 及Western blot 鉴定Fig.1㊀Identification of recombinant VP2protein by SDS-PAGE and Western blot2.2㊀重组VP2蛋白的表达条件优化为了进一步提高重组VP2蛋白的可溶性表达量,分别从诱导时间㊁温度㊁IPTG 浓度对表达条件进行优化,SDS -PAGE 结果显示,25ħ和30ħ诱导时重组VP2蛋白可溶性表达量最高,选择30ħ进行诱导表达(图2A);而IPTG 浓度变化对目的蛋白可溶性表达量的影响并不大,故选择低剂量的0.1mmol /L 作为最佳浓度(图2B);诱导表达12h 时重组VP2蛋白可溶性表达量已达最高,继续培养目的蛋白的含量并没有明显提高(图2C)㊂综上,最终得出目的蛋白最佳诱导表达条件:0.1mmol /L IPTG 在30ħ诱导表达12h,可获得较高表达量的可溶性VP2蛋白㊂2.3㊀重组蛋白VP2的纯化采用硫酸铵沉淀法进行第一步纯化,SDS -PAGE 结果显示,重组VP2蛋白在硫酸铵含量为20%时已经开始出现沉淀,到40%时可完全沉淀(图3A),所以本研究采用40%硫酸铵对重组VP2蛋白进行纯化㊂用Tris -HCl 缓冲液溶解后,透析除去硫酸铵,再进行Ni 2+亲和层析纯化,经咪唑梯度洗脱分离纯化重组VP2蛋白,SDS -PAGE 及Western blot 检测结果表明,经二步法纯化获得的重组VP2蛋白的纯度约为90%(图3B)㊂431㊀第4期陈玉梅等:猪细小病毒病毒样颗粒的制备及其免疫评价A:M.Marker;1㊁3㊁5㊁7分别为16㊁25㊁30㊁37ħ诱导表达后的超声上清;2㊁4㊁6㊁8分别为16㊁25㊁30㊁37ħ诱导表达后的超声沉淀㊂B:M.Marker;1㊁3㊁5㊁7分别为IPTG 浓度为0.1㊁0.3㊁0.5㊁0.7mmol /L 诱导表达后的超声上清;2㊁4㊁6㊁8分别为IPTG 浓度为0.1㊁0.3㊁0.5㊁0.7mmol /L 诱导表达后的超声沉淀㊂C:M.Marker;1㊁3㊁5㊁7分别为诱导6㊁12㊁16㊁20h 的超声上清;2㊁4㊁6㊁8分别为诱导6㊁12㊁16㊁20h 的超声沉淀A:M.Marker;1,3,5,7represent ultrasonic supernatant induced at16ħ,25ħ,30ħand 37ħ,respectively;2,4,6,8represent ultrasonicprecipitation induced at 16ħ,25ħ,30ħand 37ħ,respectively.B:M.Marker;1,3,5,7represent ultrasonic supernatant inducedat the IPTG concentration of 0.1,0.3,0.5,0.7mmol /L,respectively;2,4,6,8represent ultrasonic precipitation induced atthe IPTG concentration of 0.1,0.3,0.5,0.7mmol /L,respectively.C:M.Marker;1,3,5,7represent ultrasonic supernatant inducedat 6h,12h,16h and 20h,respectively;2,4,6,8represent ultrasonicprecipitation induced at 6h,12h,16h and 20h,respectively图2㊀pET28a -VP2诱导表达条件优化Fig.2㊀Optimization of induced expressionconditions of pET28a-VP2A:硫酸铵沉淀初步纯化VP2蛋白㊂M.Marker;1 4.分别为20%㊁30%㊁40%及50%(NH 4)2SO 4沉淀㊂B:Ni 2+亲和层析纯化VP2蛋白㊂M.Marker;1 2.Ni 2+纯化的VP2蛋白A:(NH 4)2SO 4purification of VP2protein.M.Marker;1 4.20%,30%,40%and 50%(NH 4)2SO 4precipitation.B:Ni 2+affinitychromatography.M.Marker;1 2.Ni 2+purification of VP2protein图3㊀重组表达蛋白VP2的纯化Fig.3㊀Purification of recombinant expression protein VP22.4㊀PPV VLPs 组装和检测分析NaCl 浓度对VP2组装形成VLPs 的影响,通过透射扫描电镜(TEM)(图4A)以及动态光散射技术(DLS)(图4B)观察VLPs 形成情况,结果显示,从大肠杆菌表达系统获得的重组VP2蛋白可以在体外组装形成结构相对较均一㊁大小约20nm 的VLPs,pH 值8.0的Tris 缓冲液中,当NaCl 浓度为150mmol /L 时VLPs 组装效率最高㊂检测VLPs 的血凝活性,证实制备的VLPs 血凝效价为1ʒ1024(图4C),说明该VLPs 正确展示了PPV 的血凝活性表位,结构接近天然PPV 病毒㊂A:电镜结果;B:动态光散射结果;C:血凝试验结果(VLPs 稀释倍数分别从1ʒ8到1ʒ1024)A:The results of electron microscopy;B:The results of dynamic light scattering;C:The results of Hemagglutination test(Dilution ratio of VLPs is from 1ʒ8to 1ʒ1024,respectively)图4㊀PPV VLPs 组装和检测Fig.4㊀Assembly and inspection of PPV VLPs2.5㊀PPV VLPs 免疫效果采用ELISA 检测昆明鼠的抗体应答情况,结果发现,VLPs 组免疫血清特异性抗体效价最高可达1ʒ25600,高剂量组略高于低剂量组;无论是高剂量还是低剂量组,抗体水平均略高于灭活疫苗组(图5)㊂531河南农业科学第49卷图5㊀免疫血清效价ELISA 测定Fig.5㊀The immunity serum titer measuredby ELISA㊀㊀病毒中和试验显示,VLPs 能有效刺激小鼠产生较高效价的中和抗体,在免疫后35d,A 组高剂量免疫组(VLPs 30μg)的抗体水平略高于B 组低剂量组(VLPs 15μg),而在免疫后42d 时低剂量组中和抗体水平则略高于高剂量组;PPV 灭活疫苗组和PBS 免疫组都几乎没有中和抗体的产生(图6A)㊂VLPs 免疫后,15μg VLPs 比30μg VLPs 免疫组的HI 抗体水平高,而PPV 灭活苗免疫组几乎没有HI 抗体产生,PBS 免疫对照组在整个免疫期都没有HI 抗体的产生(图6B)㊂图6㊀免疫血清中和抗体和HI 抗体检测Fig.6㊀Detection of neutralizing antibody and HI antibody3㊀结论与讨论原核表达系统可以实现目的蛋白的高效表达㊁降低生产成本,在兽用疫苗市场有广泛应用前景㊂PPV VP2蛋白在体外经重组表达后能自我装配成VLPs 结构,能刺激机体产生中和抗体㊂因此,实现VP2蛋白在原核表达系统的高效可溶性表达对PPV VLPs 疫苗研究具有重要意义㊂国内外学者在原核表达PPV VP2蛋白上开展了一系列研究,司艳红等[16]在E.coli 中成功表达了以包涵体形式存在的VP2融合蛋白,经复性处理后未能得到VLPs;宋品等[17]在E.coli 中获得与SUMO 标签融合表达的PPV VP2蛋白,经切除标签获得VLPs㊂司艳红等[16]虽然在原核表达系统中表达获得重组VP2蛋白,但是却难以实现可溶性表达,更难于形成VLPs 结构;宋品等[17]在原核表达系统中获得带有较大融合标签的重组VP2蛋白,但在后续组装VLPs 过程中,需要切除标签,增加操作难度,提高了VLPs 制备成本㊂本研究采用原核表达系统成功获得可溶性PPV VP2蛋白,用DNAStar 软件分析PPV VP2蛋白氨基酸序列,VP2蛋白共含有579个氨基酸,其分子质量约为64.3ku㊂SDS -PAGE 结果显示,重组VP2蛋白在约64ku 处有明显目的条带,通过与伴侣蛋白共表达的方式可以明显增加目的蛋白的可溶性表达量,提高重组蛋白活性㊂经硫酸铵盐析沉淀和Ni 2+柱亲和层析2步纯化法获得纯度约90%的重组VP2蛋白㊂由于PPV VLPs 形成效率显著影响VLPs 疫苗的免疫保护效果,经VLPs 组装条件的优化,本研究发现,PPV VP2蛋白在pH 值8.0的Tris 缓冲液㊁150mmol /L NaCl 浓度条件下VLPs 形成率最高,最终获得与天然PPV 病毒结构类似的VLPs 结构,透射电镜和动态光散射检测结果表明,制备的VLPs 大小约20nm,结构均一㊁形状规则,且具有血凝活性,说明该VLPs 能够正确展示PPV 的血凝活性表位,与前述杆状病毒表达系统中获得的VLPs 结构类似[10-15]㊂进一步用PPV VLPs 疫苗免疫昆明鼠进行动物试验,证明制备的VLPs 疫苗刺激机体产生的特异性抗体效价高达1ʒ25600,说明制备的VLPs 疫苗能有效刺激机体B 淋巴细胞活化,产生明显优于PPV 灭活疫苗特异性抗体,有良好的应用前景㊂631㊀第4期陈玉梅等:猪细小病毒病毒样颗粒的制备及其免疫评价参考文献:[1]㊀MESZAROS I,OLASZ F,CSAGOLA A,et al.Biology ofporcine parvovirus(ungulate parvovirus1)[J].Viruses,2017,9(12):393-398.[2]㊀OH W T,KIM R Y,VAN-GIAP N,et al.Perspectives onthe evolution of porcine parvovirus[J].Viruses,2017,9(8)196:1-13.[3]㊀袁美芝.猪细小病毒病流行的调查与防疫分析[J].畜牧兽医科学(电子版),2017(5):1-2.YUAN M Z.Investigation and epidemic prevention of por-cine parvovirus disease[J].Animal Husbandry and Veter-inary Science(Electronic 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