小鼠原代脂肪细胞的分离培养方法

细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。

由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。

同时也为以后传代培养创造条件。

原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。

用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。

用吸管吸去上清液。

将组织块贴于培养瓶进行培养。

2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。

370C磁棒搅拌消化20－30分钟。

然后终止消化。

用几层无菌纱布过滤。

取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。

弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。

取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。

取材应严格无菌。

取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。

要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。

取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。

二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。

动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。

放入孵化箱中孵养待用。

2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。

第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。

由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。

ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。

随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。

文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。

1　胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。

近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。

研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。

利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。

试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。

国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。

细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。

（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。

(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。

不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。

若必须推迟，可保存在4℃，72h。

1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。

再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。

静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。

2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。

3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。

分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。

置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。

一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。

注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。

2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。

由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。

36细胞培养旳过程及注意事项细胞旳培养过程及注意事项；根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种；1.组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪；2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞旳培养过程及注意事项根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。

一、原代培养（一）过程原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种及培养等环节。

原代培养旳措施诸多, 基本和最常用旳是组织块培养法和分离细胞法。

1.组织块培养法(1)基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪将附在其上旳脂肪和结缔组织清除洁净。

再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利旳眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次, 直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。

2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养瓶皿中, 并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上, 量不要过多, 要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一侧旳对侧面加足培养液, 勿使组织块与培养液接触, 塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块旳一侧朝上, 静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1 h到3h后翻瓶, 使贴壁旳组织块浸没与培养液中, 静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液, 或者根据培养瓶种颜色旳变化确定换液时间。

2.注意事项1）、组织块接种后旳前3天, 从组织块向外迁徙旳细胞数很少, 组织块旳黏附不牢固, 在观测和移动旳过程中, 注意不要引起液体旳振荡。

要防止常常翻动和振动, 否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2）、加入旳培养液不适宜过多, 防止浸泡旳组织块受轻微旳波动而脱落下来。

酵母提取物对小鼠肝损伤保护作用试验方案酵母提取物抗氧化能力的测定概述：自由基是指是机体代谢的正常产物，在体内有很强的氧化反应能力，可以在细胞代谢的过程中不断地产生。

大量的研究结果证明，自由基是衰老的决定因素。

在生命活动过程中产生的各种自由基中轻自由基的作用最强，进攻性也最强，几乎可以和所有的生物分子、有机物或无机物发生不同类型的化学反应。

超氧阴离子不仅自身具有毒性，而且可以通过其他反应产生更多的氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用。

试验拟采用DPPH自由基体系、超氧阴离子(O2-)自由基体系、羟自由基(HO-)体系以及还原力测定体系评价酵母提取物的抗氧化活性。

试验方法1）DPPH 自由基清除试验DPPH储备液配制：精密称取19.7 mg DPPH溶解于25 mL甲醇中，再吸取2.5 mL溶液，以甲醇补足体积至25 mL，得到200 µM DPPH母液，暗处保存备用。

药品及对照品储备液配制：酵母提取物采用甲醇溶解，得到终浓度为1 mM的母液。

再将母液加甲醇稀释至一定浓度梯度，加3 mL于比色管中（对照组加入3 mL甲醇或水），再加入1 mL DPPH母液，剧烈震荡后，与暗处保存30 min，以甲醇做空白，测其517 nm吸光值。

以Vc作为阳性对照，各组反应平行测定三次，DPPH自由基清除率按照下面公式计算：×100DPPH自由基清除率（%）=A0−A1A0式中A0代表对照组的吸光值；A1代表加药组的吸光值。

2）超氧阴离子(O2-)自由基清除试验采用NADH-PMS方法评估酵母提取物对超氧阴离子自由基的清除能力。

试管中依次加入1 mL NBT (81µM)溶液，1 mL NADH (468µM )溶液，1 mL不同浓度的待测溶液，0.4 mL PMS (88µM)溶液，充分混匀，静置5 min，在560 nm处测其吸光值。

用水代替待测溶液做阴性对照，水代替PMS做本底组对照，Vc做阳性对照。

原代角质形成细胞的分离培养方法原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多，人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究，因为细胞系常常由于体外长期培养，而容易丢失原有的生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。

原代细胞刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反应体内生长特性，原代细胞的活力和生长状态都比较好，细胞的纯度和基因保留可达到90%以上，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究，使用原代细胞进行实验，可以获得更准确的研究和数据。

为了更好的服务于广大科研工作者，赛百慷技术人员特提供了角质形成细胞分离的常用方法，技术因人而异仅供参考：角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白。

根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。

基底细胞层又称生发层，棘细胞层，颗粒层，透明层，角质层。

角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。

在单一移行过程中，角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。

新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层。

细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织，细胞生长状态为贴壁培养。

需要的实验试剂：1.培养基1：iCell原代角质细胞培养体系4.基础培养基：DMEM/F125.缓冲液：无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.46.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA8.消化液3：0.1%Ⅰ型胶原酶9.75%医用酒精10.胎牛血清（FBS）实验器械：1.培养皿2.T-25细胞培养瓶3.100目不锈钢网筛4.200目不锈钢网筛5.眼科剪6.眼科镊7.离心管（15ml、50ml）实验步骤：1.新鲜的包皮组织，装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中，于保温盒中，冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。

小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养娜几娜;王凌鹏;马艳;侯月梅【摘要】目的:观察原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征.方法:Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶消化心脏组织,差速贴壁分离法.结果:12 h心肌细胞基本贴壁,第2天可长成单层,第3～4天细胞伸出伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或细胞单层,搏动呈同步性,收缩明显有力,搏动频率为30～120次/min.结论:用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2008(031)007【总页数】2页(P786-787)【关键词】乳鼠;心肌细胞;培养【作者】娜几娜;王凌鹏;马艳;侯月梅【作者单位】新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,干细胞移植研究中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R-332心肌细胞培养已成为心血管研究的基本方法和手段之一，目前在心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面已开展了多项基础研究。

其中体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点,并具有自发性节律搏动,且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素的影响等特点。

利用培养的心肌细胞在探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节,研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理、信号通路、对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子等方面具有广阔的应用前景,故引起了人们的高度重视并竞相进行与心肌细胞培养有关的研究[1]。

心肌细胞培养的常见动物是大鼠,常用的细胞培养方法包括新生大鼠心肌细胞的培养和成年大鼠细胞的培养。

为观察原代培养小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征，本研究用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞。

SD大鼠脂肪干细胞原代培养实验步骤材料准备：3-5只10-15日龄新生SD大鼠（刚刚开始长白毛）灭菌器械（镊子、眼科直剪、眼科弯剪、磁珠）5mL注射器，0.22μm滤器泡沫板、图钉（固定大鼠用）75%乙醇预冷的无菌PBS水，装在两个培养皿内15mL和50mL无菌离心管细胞筛无菌培养瓶培养基（F12+10%FBS+1%双抗）1．提前将所需物品全部放入超净工作台，紫外消毒30min。

2．配制0.1%Ⅰ型胶原酶约5mL，称取0.005gⅠ型胶原酶，溶解到5mL 超纯水里，混匀。

在超净工作台内，用0.22μm的滤器过滤除菌。

3．大鼠脱颈处死后放入75%酒精浸泡5-10min，放入超净工作台，将大鼠固定在泡沫板上。

4．依次剪开大鼠腹股沟区皮肤直至腹腔，暴露脂肪组织。

更换新的剪刀镊子，将脂肪组织取出放至PBS中，注意不要剪到血管。

5．P BS涮洗一遍后，仔细剔除脂肪组织上多余的血管和淋巴结，再用PBS涮洗一遍。

用新的镊子将脂肪组织夹到50mL离心管口，弯剪反复剪碎（剪10min），剪好后加入2-3倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶和灭菌的磁珠，37℃，温浴，每隔5min震荡一次（磁珠搅拌器）。

注：也可以采用磁珠37℃一直搅拌，这样可以加快消化效果缩短消化时间。

6. 消化完成后将细胞悬液转移至新的15mL离心管中，1200rpm/min离心4min，弃上层脂滴泡沫和上清液，用完全培养基重悬沉淀。

7. 将上一步得到的细胞悬液经细胞筛过滤（可以多加一点用于稀释细胞悬液，过筛的时候轻松一点），1200rpm/min离心4min，弃上清，完全培养基重悬，转入培养瓶，置37℃培养箱培养。

人肺的成纤维细胞1.准备2个50ml的离心管，加入20ml的1640+10%FBS+0.1%三抗。

置于冰盒内。

手术标本取距离肿瘤2cm的标记CAF；距离肿瘤大于2cm的标记NF。

取回的组织在超净台内处理。

2.用1%双抗PBS清洗组织，直至溶液清洗。

尽量去除血清及杂志。

去除血管（黑）等附属物。

3.用剪刀剪碎组织（时间5min以内），大小1mm3,加入双抗PBS,将组织吹散，静止15min,更换新的PBS，离心沉淀组织块。

4.用FBS打湿25cm2培养瓶底，吸掉多余的FBS，静置。

准备200ul 的tip剪掉尖头，用火烧弯。

200ul的tip吸取组织快，接种于培养瓶内，每瓶大约25块。

将培养瓶倒置，加入2ml的1640+10%FBS+0.1%三抗，置于培养箱中，6.除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。

注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。

7.传代用0.25%胰酶常规消化，以1:2传代，传代完后，采用差速贴壁法纯化一次，即待细胞贴壁1.0 –1.5 h后(即绝大多数成纤维细胞都已经贴壁)，弃去未贴壁的细胞和培养液，更换新的培养液。

鼠成纤维细胞的原代培养1.小鼠颈椎脱臼致死,置于75%的酒精中,转移到超净台内.2.酒精擦拭小鼠2次.镊子夹取皮肤,剪开笑口,钝性分离.剪开肿瘤块外包膜(NF)一个小口,剥离出肿瘤块放入一个培养皿中.剪掉外包膜,放入另一个培养皿中（NF）.洗涤两次.封口转移至细胞放内.3.NF培基吸走,用剪刀剪碎至0.5-1mm3CAF剪取肿瘤块的内包膜，剪碎至0.5-1mm3Ⅳ型胶原蛋白（或胰酶），4℃（或37℃）培养箱过夜。

（或者此步骤省掉）。

4.用纯的血清或者20%血清浸湿组织块。

弯头吸管（注射器）吸取组织块，培养瓶种植0.5CM间隔，15-20块/25ML培养瓶。

5.将组织块加到培养瓶壁上，竖起，培养箱中培养2-4h，直至贴壁。

加入培养基培养。

翻动培养瓶使底朝上，加入2-3ML的培养基，塞紧瓶塞，置于培养箱，2-3h,待组织贴壁。

小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【摘要】为分离、培养高纯度原代小鼠肝实质细胞,并鉴定其纯度及生物活性,试验采用原位两步循环灌流法及多次低速差速离心法分离纯化肝实质细胞,促贴壁培养基原代培养,台盼蓝检测其存活率,PAS反应检测其糖原合成能力,免疫荧光化学检测细胞中CK18表达情况.结果表明:每只小鼠可获取约1.5×106个细胞,存活率>97％;镜下发现细胞在接种后6 h开始贴壁,72 h贴壁细胞生长状态良好,胞体变大、不规则,细胞间相互靠拢呈岛状或条索状连接;肝细胞出现成片紫红色糖原颗粒,CK18在细胞中均匀分布;糖原反应联合CK18免疫荧光显示细胞纯度在90％以上.说明该试验所用方法分离出肝实质细胞数量和存活率高,促贴壁培养基培养的肝实质细胞纯度高,为细胞代谢、细胞毒性等的研究奠定了基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】5页(P7-11)【关键词】小鼠;肝实质细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023【正文语种】中文【中图分类】Q813.11肝脏是哺乳动物机体内重要的解毒和代谢器官［1］。

当肝脏受到物理、化学或生物性损伤时，会产生肝肿瘤、中毒性肝病、肝硬化、急性重型肝炎等各种肝病［2］，而阐明各种肝病的发生机理是预防和治疗肝病、寻找开发新药物的第一步。

目前，将肝细胞分离、纯化并进行体外原代培养已成为探索肝病发病机制常用手段［3］，并在肝病相关研究中起着越来越重要的作用。

小鼠脾细胞观察实验报告(共10篇) 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告山东大学科目细胞生物学实验题目小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1. 细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX动物细胞培养技术【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；【实验原理】（一）. 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。

细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。

培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直至第一次传代为止。

2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。

原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型（二）. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2020, 42(12): 2256-2265DOI: 10」1844/cjcb.2020.12.0017脂肪肝细胞模型的研究进展冯秋琪「任国艳X乔香君2柳嘉'夏凯彳（'河南科技大学,食品与生物工程学院，洛阳471003; 2郑州航空港经济综合实验区口岸业务服务局，郑州451150;'中国食品发酵工业研究院，功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室，北京100015）摘要 脂肪肝是仅次于病毒性肝炎的第二大肝病.脂肪肝的发病率不断升高，且发病年龄日 趋年轻化，正严重威胁人类的健康。

脂肪肝包含一系列病理症状，随病情进展，患者可发生脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞性肝癌。

一般而言，脂肪肝属于可逆性疾病，通过早期诊断和及时治疗往往能 恢复正常。

细胞模型是研究脂肪肝病理机制的重要途径.该文讨论了脂肪肝的发病机制，并从细胞模型使用的细胞类型（动物和人的原代肝细胞、永生细胞系、诱导多能干细胞分化而来的类肝细胞 和精密肝切片）、培养方式（单独培养、共培养、三维培养）和诱导方式（高脂、高糖和酒精）这三个方面对近年来常用的细胞培养模型进行总结和分析，以期为脂肪肝的研究和药物筛选提供参考。

关键词 酒精性脂肪肝；非酒精性脂肪肝；细胞模型；细胞系Advances in Cell Models of Fatty Liver DiseaseFENG Qiuqi', REN Guoyan 1*, QIAO Xiangjun 2, LIU Jia 3, XIA Kai 3收稿日期:2020-05-21接受日期:2020-09-04*通讯作者。

Tel: 159****9597, E-mail: *****************Received: May 21,2020Accepted: September 4,2020*Correspinding author. Tel: +86-159********, E-mail: renguoyan@ URL: /arts.asp?id=5415{^College of F ood and Bioengineering, Henan University of S cience and Technology, L u oyang 471003, China;~Port Bureau Of Z hengzhou Airport Economic Integrated Experimental Zone. Zhengzhou 451150, China;'Beijing Key Laboratory of I nnovative Development of F unctional Staple and the Nutritional Intervention forChronic Disease, China National Research Institute of F ood and Fermentation Industries, Beijing 100015, China)Abstract Fatty liver disease is currently one of the most common liver diseases in the world, and it has be ­come the second largest liver disease after viral hepatitis. The incidence of fatty liver disease is increasing, and the ageof onset is getting younger, which is a serious threat to human health. Fatty liver disease contains a series of pathologi ­cal symptoms. As the disease progresses, patients may develop steatohepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Generally speaking, fatty liver disease is a reversible disease, and early diagnosis and timely treatment can often lead to a return to normal. Cell model is an important way to study the pathological mechanism of fatty liver disease. In thispaper, the pathogenesis of fatty liver disease is discussed, and the commonly used cell culture models in recent yearsare summarized and analyzed from the three aspects of cell type (primary hepatocytes of animals and humans, immor ­tal cell lines, hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells, and precision-cut liver slices), culturemode (monoculture, coculture, three-dimensional culture) and modeling method (high-fat, high-sugar and alcohol)used in the cell model. This will provide reference for the study of fatty liver disease and drug screening.Keywords alcoholic fatty liver disease; nonalcoholic fatty liver disease; cell model; cell lines 脂肪肝的主要特征是肝脏中脂肪沉积过度，患 者的临床表现有肝细胞炎症和肝纤维化等。

绝密★启用前冲刺2023年高考生物真题重组卷01湖北专用注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、考生号等填写在答题卡和试卷指定位置上。

2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡对应题目的答案标号涂黑。

如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。

回答非选择题时，将答案写在答题卡上。

写在本试卷上无效。

3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。

一、单项选择题：本题共20小题，每小题2分，共40分。

在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。

1、（2022·湖北·统考高考真题）水是生命的源泉，节约用水是每个人应尽的责任，下列有关水在生命活动中作用的叙述，错误的是（）A．水是酶促反应的环境B．参与血液中缓冲体系的形成C．可作为维生素D等物质的溶剂D．可作为反应物参与生物氧化过程【答案】C【分析】细胞内的水的存在形式是自由水和结合水，结合水是细胞结构的重要组成成分；自由水是良好的溶剂，是许多化学反应的介质，自由水还参与许多化学反应，自由水对于营养物质和代谢废物的运输具有重要作用；自由水与结合水不是一成不变的，可以相互转化，自由水与结合水的比值越高，细胞代谢越旺盛，抗逆性越低，反之亦然。

【详解】A、自由水是化学反应的介质，故水是酶促反应的环境，A正确；B、血液中的缓冲对是由离子组成的，离子溶解在水中才能形成缓冲体系，B正确；C、维生素D属于脂质，脂质通常都不溶于水，C错误；D、自由水能参与化学反应，故水可作为反应物参与生物氧化过程，D正确。

故选C。

2、（2022·辽宁·统考高考真题）“一粥一饭，当思来之不易；半丝半缕，恒念物力维艰”体现了日常生活中减少生态足迹的理念，下列选项中都能减少生态足迹的是（）①光盘行动①自驾旅游①高效农业①桑基鱼塘①一次性餐具使用①秸秆焚烧A．①①①B．①①①C．①①①D．①①①【答案】A【分析】生态足迹：（1）概念:在现有技术条件下，维持某一人口单位生存所需的生产资源和吸纳废物的土地及水域的面积。

脂肪细胞培养人脂肪细胞（adipocyte）是十分好的讨论对象。

它们是正常细胞，常用来自大网膜脂肪组织或皮下结缔组织培养。

在特别培养条件下，它们不增殖，能分化成类似成熟的脂肪细胞。

在无血清培养液中，前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，能生长增殖、汇集，并可传代。

常用前脂肪细胞（preadipocyte）原代培养法来讨论脂肪细胞的发育。

【材料】 1．组织来源腹股沟区皮下或腹膜后的脂肪组织。

2．培养用试剂 (1）清洗液：HBSS，不含Ca2+, Mg2+和，加入100U/ml和100ug/ml。

(2）消化液：Trypson/EDTA,0.05％，0.53 mmol EDTA ; Ⅱ型胶原酶，配成1 mg/ml HBSS液。

(3)溶解红细胞缓冲液10mmol KHC03,0.1 mmol EDTA,0.154mol NH4Cl，溶于去离子蒸馏水中。

(4）分化液 1）分化液（EDTA/F12+)：DMEM/F12添加15mmol HEPES,15mmol NaHC03,33umol、0.5 umol17 umol 泛酸（pantothenic acid),0.2nmol（triiodo-thyronine) ,0.1umol （dexamethasone) ,50U/ml、50ug/ml。

2）地塞米松：制备5 mmol 的EtOH干液，储存于-20℃中，稀释成10-5 mol的DMEM/F12的稀释液，用法时加入至1.Oml/l00ml的DMEM/Fl2。

3)三碘甲状腺原氨酸：制备蒸馏水配0.2mmol干液（106x终浓度）保存于-20℃，用DMEM/F12稀释成1/1000，然后加入100u1/100ml DMEM/F12。

4）泛酸：制备1000x终于浓度（17 mmol )蒸馏水配的用法液，分装成每0.5m1等分，保存于-20℃，用法时加入至1.Oml/l00m1的DMEM/F12, 5)DMEM/Fl2;1:1; DMEM的混合物和Ham补有F12养分混合物，含15 mmol NaHC03,15mmol HEPES,50U/ml和50ug/ml。