新型含芘荧光探针分子与蛋白质相互作用的光谱研究

蛋白相互作用一、技术简介BiFC是由Hu 等在2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[1]. 有报道在GFP 的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。

如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。

在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。

其后发展出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比。

因此，BiFC 技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。

BiFC技术以下几个特点使其对于研究蛋白质相互作用具有独特的优势：1、能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备。

实验简单、快捷、直观，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞. 该技术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音. 但是，该技术与大多检测蛋白质相互作用的技术一样，也存在着假阴性和假阳性的问题，需要在实验中仔细验证。

β—紫罗兰酮与β—乳球蛋白相互作用的光谱法研究摘要：在pH=7.0，t=37℃条件下，采用荧光光谱和紫外可见-吸收光谱研究了β-紫罗兰酮与β-乳球蛋白的相互作用。

研究的结果表明：这种相互作用使β-乳球蛋白发生内源荧光猝灭，其机制为静态猝灭。

通过计算得到了两者的结合常数（k=0.605×103L/mol）和结合位点数（n=1）。

关键词：β-紫罗兰酮;β-乳球蛋白;荧光猝灭; 同步荧光谱; 紫外可见-吸收光谱;引言β-紫罗兰酮（β-ionone）是一种芳香族化合物，结构（如图2）中含有一个芳香苯环，具有疏水性。

它广泛存在于天然食物中，比如水果、蔬菜、谷物及牛奶中，在医药工业中还可以用于合成维生素A和β-胡萝卜素[4，5]，这与人们的生活息息相关。

β-紫罗兰酮是一个单体，却表现出较强的抗癌作用[6，7]。

研究蛋白质与β-紫罗兰酮的相互作用，可以为了解β-紫罗兰酮的生物活性机制提供重要线索。

1 实验部分1.1 仪器和试剂F-4600型荧光分光光度计（日本日立公司）;UV-1800型紫外可见分光光度计（上海Shimadzu公司）;UB-10标准型PH计（上海华耀贸易公司）;FA1604B 型电子分析天平（北京赛多利斯有限公司）;β-乳球蛋白和β-紫罗兰酮购买于美国Sigma公司;磷酸钠缓冲液所用试剂为国内生化公司购置的分析纯;所用水为超纯去离子水。

1.2 实验方法准确称量β-紫罗兰酮并配置成浓度为1mmol/L的溶液，准确称量β-乳球蛋白并配置成5 mg/ml的溶液，其中使用的缓冲液均为磷酸钠缓冲液（pH=7.0），置于4 的冰箱中保存。

在10 ml比色管中依次加入pH=7.0的缓冲溶液、1.0mlβ-乳球蛋白溶液和一定量的β-紫罗兰酮溶液，然后在27 和37 水浴锅中充分培养30分钟后开始测试荧光光谱。

荧光光谱测量，激发光狭缝和发射光狭缝均为 2.5nm。

內源发射荧光是以280nm作为激发光波长，记录300nm-400nm范围的发射光谱;同步荧光是固定激发波长与发射波长的间距分别为15nm和60nm，记录240-320nmm范围的荧光光谱。

蛋白质相互作用的主要研究方法细胞承受外源或是源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。

在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。

虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大局部的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。

因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。

在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。

研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。

研究蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。

蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、外表等离子共振、荧光能量转移等几种。

1 免疫共沉淀免疫共沉淀〔Co-Immunoprecipitation〕是以抗体和抗原之间的专一性作用为根底的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞生理性相互作用的有效方法。

其根本原理是:细胞裂解液中参加抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进展SDS-PAGE及Western blotting分析。

免疫共沉淀既可以用于检验的两个蛋白质在体的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原那么都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。

免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比拟高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。

荧光光谱法在蛋白质研究中的应用尹燕霞;向本琼;佟丽【摘要】荧光光谱法对研究蛋白质结构及其构象变化是很重要的.描述了荧光光谱的概念、发光机理及特点,介绍了荧光光谱仪的仪器原理和结构,记述了荧光光谱技术在检测蛋白质的构象变化、蛋白质的含量和酶活性方面的具有应用.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2010(027)002【总页数】5页(P33-36,40)【关键词】荧光光谱法;蛋白质;构象【作者】尹燕霞;向本琼;佟丽【作者单位】北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875【正文语种】中文【中图分类】O657.3;TQ937某些物质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光称为荧光。

荧光光谱在各方面的应用及有关的方法称为荧光光谱技术。

1.1 荧光发光机制每一个分子具有一系列分离的电子能级,每一电子能级中又有一系列的振动能级和转动能级。

当物质被光照射后,大约在10-15s内光被物质吸收,物质分子获得能量,分子内的电子跃迁到较高能级而变成激发态。

处于激发态的分子很不稳定,它首先通过内转换将部分能量转移给周围分子,回到最低电子激发态振动能级(称为第一级电子激发态振动能级),处于这一能级的分子平均寿命大约是10-8s,如果这时分子通过发射相应的光量子来释放剩余能量而回到基态的各个不同的振动能级,就产生了荧光。

因此,最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的基础。

由于分子发射荧光前已有一部分能量被消耗,所以荧光能量要比物质吸收的光能量小,因而荧光的发射波长总比激发波长长。

1.2 常用荧光参数荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。

因而被广泛地应用于各个研究领域。

它能提供包括激发谱、发射谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命等许多物理参数,这些参数从各个角度反映分子的构象情况,通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推断生物大分子在各种环境下的构象变化,从而阐明蛋白质结构与功能的关系。