分子荧光分析

一、实验目的1. 熟悉分子荧光法的基本原理和操作步骤。

2. 掌握荧光光谱仪的使用方法。

3. 通过实验，测定罗丹明B的荧光光谱，分析其激发光谱和发射光谱。

4. 掌握荧光定量分析的方法。

二、实验原理分子荧光法是一种灵敏的定量分析方法，基于物质在特定波长范围内吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态，再回到基态时释放出一定波长的荧光。

罗丹明B作为一种荧光物质，在特定波长范围内具有明显的荧光特性。

通过测定罗丹明B的激发光谱和发射光谱，可以确定其最佳激发波长和发射波长，从而进行定量分析。

三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光谱仪、紫外-可见分光光度计、移液器、容量瓶、试管等。

2. 试剂：罗丹明B标准溶液、无水乙醇、蒸馏水等。

四、实验步骤1. 准备罗丹明B标准溶液：准确移取一定量的罗丹明B标准溶液，用无水乙醇稀释至100mL，配制成一定浓度的罗丹明B标准溶液。

2. 测定激发光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，扫描激发光谱，记录激发波长范围内荧光强度的变化。

3. 测定发射光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，以激发光谱中最大激发波长为激发波长，扫描发射光谱，记录发射波长范围内荧光强度的变化。

4. 荧光定量分析：取一定量的罗丹明B样品溶液，按照上述步骤测定其激发光谱和发射光谱，计算样品溶液中罗丹明B的浓度。

五、实验结果与讨论1. 激发光谱：罗丹明B的激发光谱显示，在激发波长为540nm附近，荧光强度达到最大值。

因此，选择540nm作为激发波长。

2. 发射光谱：罗丹明B的发射光谱显示，在发射波长为590nm附近，荧光强度达到最大值。

因此，选择590nm作为发射波长。

3. 荧光定量分析：根据罗丹明B的激发光谱和发射光谱，以及标准曲线，计算样品溶液中罗丹明B的浓度为1.2×10^-5 mol/L。

第1节分子荧光分析原理
分子荧光分析是一种基于光谱学的分析技术，用于检测其中一种物质的含量，它的原理是将吸收的光转换成可见的发射光，并通过检测发射光的强度来测定该物质的含量。

分子荧光分析的基本原理是，物质在紫外光的照射下，由其原子中的电子进行内部能量转换，当原子中的电子进行能量转换时，物质会释放可见光，而这种可见光的强度取决于物质中所含的物质的量。

分子荧光分析的技术基础是分子的能级构型。

分子的能级构型指的是一种构型，它包含一种特殊的分子电子构型，其中电子能量的分布形式是一种动态的状态，它可以在受到激发条件时发生变化，从而由原子中的一种状态转变成另一种状态。

分子荧光分析技术利用一种叫做“荧光”的物理现象，荧光是指在紫外光的照射下，物质由其原子中的电子发射出可见光，而这种可见光的强度取决于物质中所含物质的量。

分子荧光分析的优点有：灵敏度高，发射光强度与激发光强度之间的比值可以高达数万倍；分辨率高，可以检测低于ppb水平的分子；壁效应低，不受外界环境的影响；灵活性高，可以检测多种物质类型；可以进行在线监测；成本低廉，可以实现连续和定期的检测工作。

总结起来，荧光分析原理是：将紫外光照射到试样中。

分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。

（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。

此种状态称为单线态。

• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。

若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。

则该分子所处的能级状态称为激发单线态。

• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。

若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。

2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。

3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。

4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。

5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。

由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。

分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析的原理是基于分子的激发态能级和基态能级之间的电子跃迁。

当分子受到外界的激发能量（如光能）时，部分分子中的电子从基态跃迁到激发态。

当电子从激发态返回基态时，会释放出荧光光子，其能量与激发态的能级差相关。

这种发光现象被称为荧光。

荧光光谱是通过测量荧光发射的强度和波长来获得的。

通常情况下，荧光光谱的波长范围较宽，可以从紫外到可见光甚至红外。

荧光峰的位置和强度可以提供分子的结构信息，如它们的共振结构、官能团的位置和取代基的影响等。

因此，荧光光谱分析被广泛应用于有机分析化学、生物化学、医药化学等领域。

在分子荧光光谱分析中，常用的实验方法包括荧光激发光谱、荧光发射光谱和荧光寿命测量。

荧光激发光谱是测量分子在不同激发波长下产生的荧光发射强度的方法。

通过测量不同波长的激发光强度和相应的荧光发射强度，可以绘制激发光谱图。

从激发光谱图中，可以确定最佳的激发波长和激发强度，以获得最大的荧光发射信号。

荧光发射光谱是测量荧光信号的强度和波长的方法。

在荧光发射光谱实验中，分子在固定的激发波长下，通过改变检测器的波长来测量荧光光谱。

从荧光发射光谱图中，可以观察到不同波长下的荧光发射峰，并判断荧光光谱的特征。

荧光寿命测量是测量分子从激发态退激发到基态的时间的方法。

荧光寿命是荧光信号从达到最大强度到减少到原始强度的时间。

荧光寿命的测量可以提供有关分子动力学和化学反应速率的信息。

分子荧光光谱分析在许多领域有着广泛的应用。

例如，在环境监测中，可以通过测量水中有机物的荧光光谱来检测水中有机污染物的存在和浓度。

在生物药物研究中，荧光标记的分子可以用于检测和定量分析生物标志物的表达和鉴定。

此外，荧光光谱分析还可以用于材料科学、食品分析等许多其他领域。

总之，分子荧光光谱分析是一种重要且常用的分析方法，通过测量荧光发射的强度和波长可以获得分子的结构和性质信息。

不同的实验方法可以用于研究不同的分子特性和反应过程。

分子荧光分析法标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]分子荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X射线范围内的荧光。

2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。

荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。

荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。

3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。

基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。

但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。

（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。

分子荧光的定性分析原理
分子荧光定性分析是一种用于确定化合物是否具有荧光性质的方法。

荧光是指分子吸收光能后发出的短波长光。

以下是分子荧光定性分析的原理：
1. 激发：荧光分析通常需要先将化合物激发到一个能级，使其能够吸收能量。

通常使用紫外光或可见光来激发化合物。

这个能级通常对应着化合物的电子跃迁。

2. 吸收：化合物吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态能级。

这个激发态能级通常是一个高能量、不稳定的能级。

3. 跃迁：电子在激发态能级上停留的时间很短，随后会再次跃迁到较低的能级。

在这个过程中，荧光光子被释放出来。

光子的能量通常比激发光的能量低，对应着较长波长的光。

4. 发射：荧光光子的发射可以通过荧光光谱来观察。

荧光光谱通常是一个峰状曲线，波峰对应着荧光发射的波长。

通过比较样品的荧光光谱与已知荧光性化合物的光谱，可以确定样品是否具有荧光性质。

5. 荧光颜色：荧光发射的波长与化合物的结构密切相关，不同化合物具有不同的荧光颜色。

因此，荧光颜色也可以用来进行分子荧光定性分析。

需要注意的是，分子荧光定性分析只能确定一个化合物是荧光性还是非荧光性，
并不能提供关于分子结构和化合物量的定量信息。

为了进行准确的分子荧光定性分析，通常需要使用荧光光谱仪或相关的仪器。

分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析是一种用于分析化学物质的基本技术，这种技术可以检测特定物质的含量或结构。

荧光光谱分析被大量应用于食品、农业、医药、环境分析等领域，在所有的分析技术中占有重要地位。

荧光光谱分析的基本原理是，经过一定的处理，把紫外线或可见光辐射照射到样品上，通过检测分子散射回来的光来测量特定分子的含量或结构。

当光辐射射到样品中时，分子会吸收辐射，然后经过一定的激发，输入一定的能量，使分子达到激发态，并以光子的形式释放这些能量，形成荧光光谱。

根据测量的荧光光谱，可以研究分子的稳定性、结构和含量。

荧光光谱分析主要有三类技术：荧光光谱仪、激发源谱仪和时间谱仪。

荧光光谱仪是一种用于检测可见光和紫外光的仪器，它可以检测样品中各种物质的荧光特性；激发源谱仪是一种用于精确测量荧光信号量的仪器，它可以同时获得多种物质的信号；时间谱仪是一种用于检测分子的荧光瞬变过程的仪器，可以检测各种分子行为的时间信息。

荧光光谱分析有一定的优势，例如精确，可以精确的检测分子的结构和运动；灵敏，可以检测出极少的物质；选择性，可以根据激发光的波长来选择不同的分子；全面，可以同时检测多种物质；适用性强，可以用于模拟各种物理和化学环境，如溶液、气体和固体等；可重复性强，可以将检测结果记录下来，以便重复使用。

荧光光谱分析的研究和应用正在不断深入，它已成为化学、生物、物理过程观察的重要手段，在食品、农业、医药、环境分析等方面均有广泛应用。

随着科学技术的发展，分子荧光光谱分析将会在更多领域有更多的应用，对于科学研究和技术应用将产生重要作用。

分子荧光光谱分析是一门复杂的学科，涵盖了物理学、化学、生物学等学科，能够有效检测分子的数量和结构，而且还可以用于模拟复杂的物理和化学环境，是一种有效的分析技术。

随着科学技术的发展，荧光光谱分析将会在更多领域有更多的应用，为社会发展做出更大的贡献。

第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecular luminescence），以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。

物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。

根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，燐光分析法和化学发光分析法。

荧光分析法历史悠久。

早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，就发现含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色，但未能解释这种荧光现象。

直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语，他还论述了Stokes 位移定律和荧光猝灭现象。

到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。

近十几年来，由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入，大大推动了荧光分析理论的进步，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展，加速了各种新型荧光分析仪器的问世，进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性，解决了生产和科研中的不少难题。

目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。