HBV拉米夫定耐药检测研究进展
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HBV拉米夫定耐药检测研究进展
日期:2010-06-06
* 欧志英1,2 综述， 何蕴韶1,2 王伟毅1 审校
（1中山大学达安基因诊断中心，广州 510080； 2中山大学解剖学教研室，广州 510080） [摘要] HBV是严重危害人类健康的重要的病毒性致病因子之一，HBV感染后可导致慢乙肝、肝
硬化甚至肝癌。我国是慢性乙型肝炎的高发区，拉米夫定是目前普遍使用的治疗慢性乙肝的核苷
类似药物，但用药后易引起HBV基因组突变而使HBV产生耐药性，降低治疗的效果，临床上
很有必要对病者的HBV基因组进行检测以及用药过程中的监测。本文综述了近年来乙型肝炎病
毒基因组耐药突变检测方法及其临床意义，为临床拉米夫定耐药突变的核酸检测和治疗由HBV
感染引起的肝脏疾病提供参考。 [关键词] HBV；拉米夫定；耐药；核酸检测
Progress on HBV Lamivudine Resistance Mutants Detection
OU Zhi-Ying1,2 He Yun-Shao1,2 Wang Wei-Yi1
(1DaAn Gene Diagnostic Center, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China）
(2 Department of Human Anatomy, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080,
China)
Abatract: Hepatitis B virus (HBV) is the most common infectious virus that affects
people all over the world; it may stimulate chronic hepatitis, liver cirrhosis and even
hepatocellular carcinomia. There is a high incidence of chronic hepatitis B virus
infection in China, lamivudine is the most commonly used nucleotide analogy to
treat chronic hepatitis B, but will induce mutations in HBV genome and cause drug
resistant. It’s very important to detect the HBV lamivudine resistant mutation. We
reviewed the significance of HBV lamivudine resistance mutation detection and
several current methods for HBV lamivudine drug resistance mutation detection
with their clinical applications. Our review will give some help on detection of
lamivudine resistant mutation and treatment of chronic HBV infection.
Key words: HBV； lamivudine； drug resistance； Nuclear diagnose
乙型肝炎（Hepatitis B）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的一种危害极为
严重的传染病。HBV是重要的肝脏疾病致病因子，主要通过性接触和血液传播，也可通过医源
性、胎源性、昆虫叮咬或与HBV携带者生活密切接触传播。世界上有20亿人感染HBV，约占
全球人口的1/3。目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.5亿，其中HBV携带者75%分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.2亿。估计全球每年有100～200万人直接死于HBV
持续感染[1，2]。慢性乙型肝炎病毒感染者中50%～75%有活跃的病毒复制和肝脏炎症，感
染的自然病程漫长，可持续30～50年, 表现为易于慢性化的特征。持续慢性HBV感染在临床
上可表现为各种不同类型的疾病，包括无症状携带状态，急、慢性肝炎，重症肝炎，肝纤维化和
肝硬化等，有的还可能发展为原发性肝癌（HCC）。 1 HBV基因组的生物学特点
HBV是DNA病毒，基因组全长约3.2 Kb，为独特的带有部分单链区的环状双链模式。基因组
简单、高度压缩、重复利用。HBV基因组共含有4个转录单元，每个转录单元构成一个独立的
开放读码框（Open Reading Fram，ORF），由于4个转录单元之间相互重叠，其ORF总长
为4.7 Kb。HBV的4个ORF（图1,表1）分别为P、X、C、S，其中S ORF长度为1 185 bp，
由S、Pre-S1和Pre-S2三个区域组成，各个区都有自己的起始密码ATG，但三个区共同合用5 端的终止密码子。S ORF编码含有226 个氨基酸的包膜主要表面蛋白，又称小表面蛋白或
表面抗原，即HBsAg，构成了HBV的抗原特性，是HBV疫苗开发的耙点。C ORF的长度为639 bp，编码HBcAg和HBeAg，HBcAg是免疫攻击的靶抗原，X ORF长465 bp，编码155
个氨基酸的X蛋白，是参与细胞凋亡的反式激活蛋白。P ORF长2 532 bp，编码844个氨基
酸的P蛋白(即HBV DNA多聚酶)，是病毒复制的主要功能单位，也是抗病毒药物开发的主要
靶标。P ORF包括括4个编码区域[3，4]，从氨基端开始分别为：①末端蛋白区(TP)，末端蛋
白在逆转录过程中与负链DNA结合。②间隔区(SD)，该区具有耐受突变，缺失并不影响聚合
酶的活性。③逆转录酶区（RT），该区包含5个功能保守序列A-E：A区（AA421-436），B
区（AA506-528），C区（AA546-550），D区（AA576-589），E区（AA592-600），
是维持反转录酶活性所必须，其中A、C、D区为酶与三磷酸核苷结合的结合域，B、E区为RNA
模板和引物定位域。目前临床应用的核苷类似药物主要靶点位于逆转录酶RT区的B及C区，HBV多聚酶的催化域是位于C区的YMDD基序。HBV基因型不同，保守区氨基酸位点不一样，
该蛋白同时具有依赖RNA的RNA聚合酶活性(RdRP)和依赖RNA的DNA聚合酶活性，即同
时有逆转录酶和DNA聚合酶的活性，能将前基因组RNA反转录成负链DNA，并以此负链DNA
为模板合成正链DNA。④RNase H区。
2 HBV的耐药性
HBV多聚酶的催化结构在自然条件下很少发生变异,但在长期药物治疗后则极易发生变异，产生
耐药性，如临床常见的免疫球蛋白耐药、拉米夫定耐药、更昔洛韦耐药等。耐药后，抑制病毒复
制的能力下降，患者血清HBV DNA反弹。各种耐药突变在基因组中核苷酸突变位点不同(表2)。
随着现代医学治疗技术的进步，准确了解某个病人体内病毒的复制状态需要详细的病毒血清学和
分子生物学信息，这些信息有助于选择正确的临床管理和治疗方案。HBV耐药核酸检测在临床
上能为慢性HBV感染病人治疗方案的选择和调整提供个性化的、关键的分子病毒学信息。
3 HBV拉米夫定耐药突变检测及其临床意义
目前治疗慢性乙肝主要用干扰素或核苷类似物，如拉米夫定、更昔洛韦等，干扰HBV复制来达
到治疗的目的[5，6]。拉米夫定（Lamivudine，3TC or Epivir)，中文名贺普汀，是口服胞核
嘧啶核苷类似物，由葛兰素史克公司在1992年研发成功并生产，1998年进入中国并被批准用
于临床，拉米夫定服用方便、不良反应少，易为患者接受，
是目前公认的最有效而安全的抑制病毒复制的核苷类似药物，该药的出现使抗HBV治疗发生了质的飞跃，使不适宜用α-干扰素治疗
或治疗无应答病人有了新的治疗选择。 HBV基因组复制要通过逆转录机制才能进行，首先形成RNA复制中间体，而RNA复制中间体
的形成需要逆转录酶的作用才得以进行，但该酶缺乏校对功能，逆转录过程中容易发生错配导致
基因突变，在HBV基因组中逆转录聚合酶的催化结合部位有一个高度保守的YMDD基序，即
酪氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸[7]，拉米夫定能够与其特异性结合，通过抑制前基因
组RNA逆转录为负链DNA及终止DNA链延伸而有效地抑制HBV DNA复制[8]，拉米夫定的
作用机理是在细胞内转化成活性代谢成分拉米夫定-5-三磷酸，它可作为一个链终止子或竞争自
然底物dCTP，抑制病毒RNA依赖的DNA聚合酶(逆转录酶)的活性[9]。治疗慢性乙肝的临床
试验表明：拉米夫定用药后血清病毒滴度明显减少，有的低至检测不出的水平，丙氨酸氨基转移
酶（ALT）活性迅速降低，血清肝酶活性正常化，肝组织病理改善，HBeAg血清转化成HBeAb，
病情稳定，阻止肝纤维化进展[8，10，11]，因此是疗效较好的抗HBV药物。拉米夫定对HBV cccDNA(Covalently Closed Circular HBV DNA,共价闭合环状HBV DNA)无直接作用，短
期治疗不能完全清除体内HBV cccDNA[12]，大多数病人需要长期的抗病毒治疗以期耗竭cccDNA库来达到清除HBV的目的。但是长期单一使用拉米夫定治疗后，病毒在药物和人体免
疫选择压力下可能产生耐药性，出现一些与以往的药物治疗慢性乙型肝炎类似的问题，例如持续
应答率不满意、部分患者停药后复发、需长期用药且出现耐药变异等[13]。拉米夫定耐药突变
在用药后6个月开始出现，呈现为逐年用药递增[10，11]，用药1年时有16%-32%患者发
生耐药变异，2年时为47%-56%，3年时达69%-75%[14]。YMDD基序是聚合酶活性所必
需的，是HBV逆转录酶的高保守区，变异后的HBV对拉米夫定的敏感性下降，从而导致治疗
失败，甚至导致病情恶化[15]。如果耐药突变发生后继续用药，不仅增加病人不必要的经济负
担和造成社会资源的浪费[16]，还可能存在严重的流行病学危害[17]。de Man等[18]报道1
例肝移植手术后HBV感染患者，乙型肝炎免疫球蛋白治疗导致HBsAg逃避变异株，用泛昔洛
韦治疗6个月(500 mg， 3次/d)无效，P基因测序发现第513位氨基酸有异亮氨酸→亮氨酸
的突变，后改用拉米夫定治疗（100 mg， 1次/d），HBV DNA水平骤降，但拉米夫定治疗12个月后HBV DNA反弹，且发生重症肝炎，最后死亡。测序发现在YMDD区域附近有突变，
因此在出现YMDD变异株后很有必要密切监视患者病情变化，包括肝脏功能、HBV DNA定量
等。如出现ALT明显升高，临床症状加重，则应立即停药，临床上检测YMDD基序变异对时调
整治疗方案、合理用药及提高疗效具有重要的指导意义。
拉米夫定耐药性的产生主要是由病毒基因组变化引起的。近年来报道了拉米夫定治疗乙肝过程中
产生的耐药突变主要集中在552位氨基酸的YMDD→YIDD/YVDD，即在HBV YMDD基序区
