山大生化实验报告 实验一、三 酵母RNA的提取和含量测定

酵母中RNA的提取与含量测定14级拔尖赵子杰 141270054一．实验目的1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。

2.掌握用苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法。

二．实验原理1.RNA的提取核酸（RNA）都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。

提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。

前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。

使用浓盐法提取RNA的时候应该注意掌握温度，直接至90~100℃浸提，避免在20~70℃的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。

这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA的一般方法。

但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的RNA纯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产。

本实验采取浓盐法。

酵母核酸中RNA的含量较多，DNA则少于2%。

RNA可溶于碱性溶液，当碱液被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA粗品。

2.RNA的鉴定目前测定核酸含量的方法主要有以下四种：定磷法（RNA/DNA）、戊糖测定法(RNA)、脱氧戊糖测定法（DNA）和紫外吸收法（DNA/RNA）。

定磷比色法是有准确，微量，快速的特点，是测定核酸含量的最好方法，戊糖测定法和脱氧戊糖测定法是通过糖的颜色反应来测定RNA和DNA的，方法简单，快速，但是当样品中含有粘多糖和蛋白质存在的时候对测定会有干扰。

在酸性条件下，RNA分子中的核算基转变为α-呋喃甲醛，后者与苔黑酚（3,5-二羟甲苯）作用生成绿色复合物，可用比色法鉴定。

三．实验器材RNA的提取： RNA的含量测定：1.干酵母粉（市售）。

1.试管1.5cmX1.5cm(X7)。

华南师范大学实验报告学生姓名吴志军学号20082502046专业生物工程年级、班级08工程1班课程名称下游技术实验项目酵母RNA提取实验类型验证设计综合实验时间2011年10月17 日实验指导老师江学文实验评分实验三酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。

2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。

一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

其中苯酚法又是实验是最常用的。

组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。

向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。

上述方法提取的RNA具有生物活性。

工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。

浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。

核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。

遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。

所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。

酵母RNA的提取（浓盐法）及成分鉴定一、实验目的：1、掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。

2、理解等电点沉淀分离两性物质的原理和基本操作。

3、掌握钼蓝反应的原理，了解戊糖和嘌呤检验的原理。

二、实验原理：1、浓盐法提取酵母RNA：酵母中RNA含量特别多，约占干重的3～10％，DNA含量很少，约占干重的0.5％或更少，且菌体容易收集（即可利用发酵工业的下脚料），因此多采用酵母来提取RNA。

；本实验采用工业上常用的浓盐法，其基本原理是在浓盐加热的条件下酵母细胞壁通透性增加或发生破损，且加热又可使酵母中蛋白质变性沉淀，使RNA以可溶性钠盐的形式游离析出。

离心去除菌体，将上清液调至RNA的等电点（pH2～2.5），使RNA沉淀析出，离心收集沉淀。

2、RNA成分鉴定:RNA酸解，其水解产物含有碱基+核糖+磷酸；碱基（嘌呤）：磷酸：核糖：戊糖在约12％的盐酸中可以发生脱水缩合成为糠醛，糠醛可与5-甲基间苯二酚(又称苔黑酚、地衣酚)缩合生成蓝绿色的物质。

该反应用于检验戊糖的存在。

三、实验步骤：1.浓盐法提取酵母RNA（1）RNA的提取：取干酵母一包（约1～2g）放入100mL锥形瓶内，加入10％NaCl溶液30mL，搅匀后将锥形瓶固定在水浴锅内，于沸水浴中加热40分钟。

（2）RNA的离心分离：将上述锥形瓶从沸水浴中取出，立即用自来水冷却至室温。

然后将锥形瓶内溶液倒入离心管，平衡后3000转／分离心10分钟,收集上清液。

（3）RNA的收集：将上清液小心倾入50mL烧杯内，在冰浴中冷却。

用6mol/LHCl溶液调pH值至RNA的等电点2.0～2.5（一滴一滴的加入，边加边搅拌，随着pH下降，白色RNA沉淀逐渐增加，至等电点时沉淀最多）。

静置冰浴中5分钟使沉淀完全，颗粒变大。

再经3000转／分离心10分钟，收集沉淀。

2.RNA成分鉴定（1）溶解RNA：在离心所得的含RNA的离心管中加入1滴蒸馏水，用玻棒把RNA搅成糊状，再加入蒸馏水至mL，然后一边搅拌一边加入5%氨水1滴，将溶液调至pH=6，使白色RNA沉淀完全溶解，成为RNA溶液。

实验三酵母核糖核酸的提取及测定预习思考题1.作为商品开发，我们更多的是应该考虑市场需求的共性还是个性？为什么？相应的，如何完成相关欲开发产品的定位？答：我认为作为商品开发，更多的应该是考虑需求的共性，尤其是市场开发前期，只有更多的考虑市场需求共性，符合消费群体的需求，产品才能推广开，在市场发展相对稳定时，可再根据不同的消费人群制定相关个性产品。

完成产品的定位，需要先做市场调研，从已有的产品入手，调查产品的需求程度，主要消费群体，市场份额等，根据调研报告进一步定位产品。

2.基于生物制药的产业开发，探讨实验室的科学研究和大工业生产之间的关系和异同之处？答：实验室的科学研究是大工业生产的基础和必要条件，在实验室研究成熟的基础上才能进行大工业生产。

二者相同之处就是基本的实验生产原理相同，不过实验室研究的条件和精准度都比较高，得到微量的目的产物；而大工业生产主要利用仪器操作，得到大量的目的产品。

一．研究背景随着人们对生物专业重视程度的增加，生物相关产业也逐渐发展起来，目前人们比较关注的就是生物制药。

在食品医药卫生领域，RNA制剂是很有前景的一个产业方向，如今市场上已有一些核糖核酸制剂产品出现。

而微生物则是工业上大量生产核酸的原料，其中以酵母最为理想。

本次实验就是酵母核糖核酸的提取及测定，通过实验让大家更了解物质分离纯化的基本设计思想及操作细节。

二．研究目标提取RNA的方法很多，工业上常采用稀碱法和浓盐法，本次实验采取浓盐法，通过对酵母的核糖核酸的提取，再用紫外吸收法测定，使学生掌握物质分离出暖的基本设计思想及主要操作细节。

三．研究策略提取RNA使用浓盐法，再用紫外吸收法测定RNA和DNA。

四．研究方案及可行性分析提取RNA使用浓盐法，在加热条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜通透性，使RNA释放出来。

再用紫外吸收法测定RNA和DNA，紫外吸收法操作简便快速，虽易受蛋白质及含有共轭双键物质的干扰，但其结果仍具有一定可信性。