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实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延深。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
生化实验操作方法生化实验操作方法是进行生化实验的步骤和操作流程的总称。
生化实验通常用于研究生物体内的生物大分子结构、组成、功能以及生物反应等方面的变化。
下面我将详细介绍生化实验的操作方法。
首先，实验前要做好准备工作。
包括准备实验所需的试剂和仪器设备，并检查仪器设备的工作情况。
同时，要进行实验场地的清洁和消毒，以确保实验的严密性和安全性。
接下来，进行实验前的样品处理。
样品可以是生物体的组织、细胞或者生物体内的某种物质。
样品处理的目的是提取和纯化所需的生物大分子或物质，使其达到实验所需的浓度和纯度要求。
常用的样品处理方法有离心、超声波破碎、酶解等。
然后，进行实验的具体操作。
根据实验的目的和要求，选择相应的实验方法和技术进行操作。
常见的生化实验方法包括蛋白质分离与纯化、核酸提取与分析、酶活性分析、分子克隆、酶联免疫吸附实验等。
在实验操作过程中，要严格按照实验方法和步骤进行操作，掌握好技术细节。
操作时要注意消毒、洗手、穿戴实验服和手套等个人防护措施，确保实验过程的安全。
实验中要保持实验器皿和工作台的清洁，并避免交叉污染。
实验后，要进行实验数据的记录和分析。
实验结果一般通过测定生物大分子的浓度、活性或者结构等指标来进行评价。
实验数据的记录可以通过手动记录、仪器记录或电脑记录等方式进行，同时要对实验数据进行统计和分析，以得到科学可靠的结论。
最后，进行实验材料和实验场地的清理工作。
彻底清洗和消毒实验器皿和设备，将废液和废弃物妥善处理。
同时对实验室进行清洁，保持环境整洁。
总结起来，生化实验操作方法包括实验准备、样品处理、实验操作、数据记录与分析以及实验清理等步骤。
准确掌握操作方法，合理选用适当的实验技术，严格遵循实验操作的规范和安全要求，才能获得可靠的实验结果，并为科研工作或医药领域的应用提供有力的支持。
实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。
以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。
两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。
与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。
1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。
然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。
这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。
密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。
颗粒在梯度中移动的快慢。
取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。
在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。
用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
通过这种方法可粗略的分离叶绿体。
实验一：分光光度法一：定义：分光光度法是根据物质对不同波长的光波具有选择性吸收的特性---即可以产生吸收光谱，而建立起来的一种定量，定性分析的方法。
分类：根据波长范围可分为紫外，可见和红外分光光度法。
特点：1，与其它光谱分析方法相比，起仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快，2，灵敏度高3，选择性好4，精密度和准确度较高5，用途广泛。
二：分光光度法基本原理：物质对光的选择性吸收1：光的基本性质：波动性，微粒性2：物质对光的选择性吸收：一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。
溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。
能复合成白光的两种颜色的光也称为互补色光。
3：吸收曲线（光谱）物质的分子内部存在状态：电子能级，振动能级，转动能级组成：紫外--可见吸收光谱，红外吸收光谱，远红外吸收光谱4、透光率和吸光度当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0 = Ia + It + Ir 透光率(transmittance)T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。
透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。
吸光度A:透光率的负对数。
A愈大，溶液对光的吸收愈多。
5、Lambert-Beer定律Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比。
式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。
三：分光光度计的基本组成(1)光源光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500 nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375 nm)(2) 单色器单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为吸光光度分析的光源。
生化实验报告
实验原理，实验结果，实验分析。
分光光度技术及蛋白含量的测定
实验一双缩脲法测定蛋白质含量
实验原理：蛋白质分子在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物，即为双缩脲反应。
在一定浓度内，颜色与浓度成正比。
实验结果:由于第五组数据误差较大，图像绘制时予以舍去。
实验分析：根据标准曲线及其公式，并血清吸光度为0.089，得出每100ml血清样品中蛋白质的克数为0.548g。
实验二考马结合法测定蛋白质含量
实验原理：考马与蛋白质结合后最大吸收峰从465nm变成595nm，即其595nm处光吸收增加量可知蛋白质的量。
实验结果:标准溶液的吸光度为0.407，标本溶液的吸光度为0.088。
实验分析：根据公式，可得样品中蛋白质的含量为10.811g/ml。
实验三紫外分光光度法测定蛋白质含量
实验原理:蛋白质具有吸收紫外线的性质，其高峰在280nm波长处。
在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比。
实验结果：
实验分析：。
第1篇一、实验目的1. 了解生化新陈代谢的基本原理。
2. 掌握生化实验的基本操作技能。
3. 通过实验验证酶促反应的特性和效率。
二、实验原理新陈代谢是生物体内物质和能量的交换与转变过程，包括同化作用和异化作用。
同化作用是指生物体将外界环境中的营养物质转变为自身的组成物质并储存能量；异化作用是指生物体将自身的一部分组成物质分解，释放能量并排出分解产物。
酶是生物体内一类具有催化活性的蛋白质，能显著降低反应活化能，加速生化反应的进行。
三、实验设备与试剂1. 实验设备：离心机、移液器、恒温水浴锅、显微镜等。
2. 实验试剂：葡萄糖、果糖、淀粉、蛋白质、DNA、RNA、酶、指示剂等。
四、实验步骤1. 酶促反应实验（1）将酶与底物混合，观察反应速率。
（2）改变酶浓度、底物浓度、pH值、温度等条件，观察反应速率的变化。
（3）比较不同酶的催化效率。
2. 新陈代谢实验（1）将生物样本（如细胞、组织等）放入反应体系中，观察物质和能量的变化。
（2）改变反应条件，如pH值、温度等，观察反应的变化。
（3）检测代谢产物，如葡萄糖、乳酸等。
五、实验结果与分析1. 酶促反应实验（1）实验结果显示，随着酶浓度的增加，反应速率逐渐加快。
（2）改变底物浓度，反应速率也随之增加。
（3）pH值和温度对酶促反应速率有显著影响，最适pH值和温度条件下，反应速率最高。
（4）不同酶的催化效率不同，如脲酶催化尿素水解速度比一般催化剂高10~10倍。
2. 新陈代谢实验（1）实验结果显示，生物样本在反应体系中发生代谢反应，物质和能量发生转变。
（2）改变反应条件，代谢反应速率发生变化。
（3）检测到代谢产物，如葡萄糖、乳酸等。
六、讨论1. 酶促反应具有高效、特异、可调节等特点，是生物体内新陈代谢的重要催化剂。
2. 新陈代谢是生物体维持生命活动的基础，酶在代谢过程中起着至关重要的作用。
3. 实验结果表明，酶浓度、底物浓度、pH值、温度等条件对酶促反应速率有显著影响。
实验一 分光光度计线性分辨范围测定一. 目的1.学习分光光度计的工作原理，掌握比色测定的基本操作方法。
2.掌握标准曲线的制作及分光光度计最佳测试浓度范围的确定。
二. 原理比色法是常用的生化分析方法。
利用分光光度计可以很方便地完成多种生物物质的定量分析。
比色法的理论基础是朗伯-比尔定律，其测定浓度范围要求在分光光度计线性分辨范围内。
光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。
肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm ；小于400nm 的光线称为紫外光；大于750nm 的光线称为红外光。
当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。
图1 Lambert-Beer 定律示意图分光光度法依据Lambert-Beer 定律：II 0lg = KCL令A = II 0lg，T =0I I，则A = KCL ，A = -lgT其中：T ：透光率A ：吸光度（有时用光密度OD 表示）I ： 透射光强度 I 0：入射光强度 K ：吸收系数 L ：溶液的光径长度 C ：溶液的浓度从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K 和溶液的光径长度L 不变时，吸光度A 与溶液的浓度C 成正比。
用标准曲线法，即可对未知样品做定量分析。
三. 实验材料及设备1. 仪器UV5200型分光光度计。
2．器材I 0IC L刻度试管：25mL×21；移液器：1mL×1；吸头几支；烧杯：250mL×2，50mL×1；洗耳球：2；滴管：2；移液管（白线）：1 mL×1，2 mL×1，5 mL×1；洗瓶、试管架、移液管架：各1。
四. 试剂的配制0.01mol/L硫氰化铁（Fe (SCN)3）溶液：称取30.000g （过量）KSCN和27.05g FeCl3·6H2O，加入2.5mol/L HCl 100mL,用蒸馏水溶解后定容至10000mL（经验提示：保质期1星期）。
(一）碳水化合物代谢实验糖(醇、苷）类发酵实验（1)原理：细菌分解糖得能力与该菌就是否含有分解某种糖得酶密切相关,故分解糖得能力各不相同，细菌分解糖类后得终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气,使培养基颜色改变，从而判断细菌就是否分解某种糖或其她碳水化合物。
（2)基本培养基：在培养基中加入0、5％-1％得糖类(单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类(水杨苷、菊糖等）、培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型.（3)实验方法：取某一种细菌得２4h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内,37℃培养2４h，观察结果并记录.（4)结果判定：如果接种进去得细菌可以发酵某种糖或醇,则可产酸,使培养基由紫色变成黄色,如果不发酵,则仍保持紫色。
如发酵得同时又产生气体,则在微量发酵管顶部积有气泡。
（5)应用:就是鉴定细菌最主要最基本得实验,特别就是对肠杆菌科细菌得鉴定尤为重要。
氧化型与发酵型（Ｏ/F）得测定（1）原理:细菌在分解葡萄糖得过程中，必需有氧得参加，称为氧化型(O),细菌在分解葡萄糖过程中可以进行无氧降解得,称为发酵型(F）。
发酵型细菌无论在有氧无氧得环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖得细菌称为产碱型（-)。
这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义.（2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5ｇ,磷酸氢二钾0、３g,葡萄糖10g,琼脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水10００mL。
将蛋白胨、盐、琼脂与水混合,加热溶解，校正PH至7、2，然后加葡萄糖与指示剂，加热溶解,分装试管，３-4ｍL/管；115℃,高压蒸汽灭菌20m ｉn,取出冷却成琼脂柱。
（3）试验方法：挑取18—2４h得幼龄斜面培养物,穿刺接种,每种细菌接种两管，于其中一管覆盖1ｍL液体石蜡，3７℃培养２4h或更长时间。
（4）结果判定:(５)应用:O／F试验主要适用于G—肠道杆菌得鉴别。
生化实验报告实验目的，通过对不同生物体进行生化实验，探索其生物学特性和生化反应规律。
实验材料，小鼠、果蝇、大豆、细菌培养基、生化试剂等。
实验方法：1. 对小鼠进行实验，将小鼠分为实验组和对照组，实验组注射一定剂量的葡萄糖溶液，对照组注射生理盐水，观察小鼠的血糖水平变化和生化指标的变化。
2. 对果蝇进行实验，将果蝇分为实验组和对照组，实验组饲养在高温环境下，对照组饲养在常温环境下，观察果蝇的生长发育和生化代谢的差异。
3. 对大豆进行实验，将大豆种子浸泡在不同浓度的盐水中，观察大豆的生长情况和生化成分的变化。
4. 对细菌进行实验，将细菌接种在不同营养基上，观察其生长速度和代谢产物的差异。
实验结果：1. 小鼠实验结果显示，实验组小鼠的血糖水平显著升高，血清中的胰岛素水平下降，对照组小鼠的血糖水平无显著变化。
说明葡萄糖溶液注射导致小鼠胰岛素分泌不足，血糖升高。
2. 果蝇实验结果显示，高温环境下果蝇的寿命显著缩短，生化代谢速率加快，对照组果蝇的寿命正常，生化代谢速率稳定。
说明高温环境对果蝇的生化代谢产生负面影响。
3. 大豆实验结果显示，在高盐浓度环境下，大豆的生长受到抑制，生化成分中的蛋白质含量下降，对照组大豆的生长和生化成分无显著变化。
说明高盐浓度对大豆的生化代谢产生不利影响。
4. 细菌实验结果显示，不同营养基对细菌的生长和代谢产物有显著影响，说明细菌的生化代谢对营养基的需求存在差异。
实验结论，通过对不同生物体进行生化实验，我们发现生物体的生化代谢受到环境因素和营养因子的影响，不同生物体对外界环境和营养条件的适应能力不同，生化反应规律也存在差异。
这些实验结果为我们深入了解生物体的生化特性和生物学规律提供了重要参考。
实验展望，未来可以进一步探索生物体的生化代谢机制，研究生物体在不同环境和营养条件下的适应策略，为生物科学领域的研究提供更多的实验依据和理论支持。
结语，生化实验是生物学研究中的重要手段，通过对不同生物体的生化特性进行研究，可以深入了解生物体的生命活动规律，为生物科学领域的发展做出贡献。
生化系统综合实验报告1. 引言生化系统是一个复杂的系统，由多个生化反应和生物分子组成。
了解和研究生化系统对于理解生物体的功能和疾病发生机制具有重要意义。
本实验旨在通过实验操作和数据分析，加深对生化系统的认识和理解。
2. 实验目的1. 掌握生化实验操作技能；2. 了解常用的生化实验仪器和试剂的使用方法；3. 学习采集和处理实验数据；4. 加深对生化反应和生物分子的理解。
3. 实验材料与方法3.1 材料- 实验仪器：分光光度计、离心机、PCR仪、电泳仪；- 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、DNA分子量标记物。
3.2 方法1. DNA提取：从植物叶片样品中提取DNA，按照DNA提取试剂盒的说明书进行操作；2. PCR扩增：通过PCR扩增特定基因片段，使用PCR试剂盒和PCR仪进行反应，优化PCR反应条件，包括温度和时间；3. 准备琼脂糖凝胶：按照说明书将琼脂糖溶解于TAE缓冲液中，并将其倒入电泳仪模型中固化；4. 准备DNA样品：将PCR扩增产物与DNA分子量标记物混合，加载到琼脂糖凝胶槽中；5. DNA电泳：将琼脂糖凝胶放入电泳仪中，设定合适的电流和时间进行电泳，观察DNA迁移结果。
4. 实验结果与讨论在本实验中，我们成功提取了植物叶片样品的DNA，并通过PCR扩增得到了特定基因片段。
下图展示了PCR电泳结果：通过结果观察，我们发现所有样品都成功扩增出了目标基因片段，并且具有相似的大小。
这说明我们的PCR反应条件是合适的，并且得到了高质量的PCR产物。
通过DNA电泳结果，我们可以看到样品之间的DNA迁移距离存在差异。
这是因为DNA分子的大小不同，在电场力下会以不同的速度迁移。
另外，我们还看到了DNA分子量标记物，在琼脂糖凝胶上形成了明显的条带。
通过与标准品的比较，我们可以估计出PCR产物的大小。
5. 结论通过本实验，我们成功地进行了DNA提取、PCR扩增和DNA电泳等生化实验操作。
生化大实验实验报告范文一蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组200-300g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配某10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，0.005mMgCL2）配置时配。
（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1：粗酶提取：马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02NKCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
三、实验结果获得PPO粗酶液供上柱使用。
实验二柱层析纯化PPO一、材料与试剂试剂：0.02MTri-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配某10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephade某G-200等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephade某G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
1．精氨酸双水解酶细菌的精氨酸双水解作用是将精氨酸经过两步水解，生成有机胺和无机氨。
鉴定细菌的精氨酸试验，无论发酵菌还是非发酵菌，革兰阳性菌还是革兰阴性菌，测的都是精氨酸双水解酶，使用脱羧酶试验培养基。
所以，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶用同一种基础培养基，为Moeller配方或Falkow配方，均须加盖石蜡油。
对于发酵菌，细菌生长后，培养基变黄为阴性，变紫为阳性；对非发酵菌，培养基颜色不变为阴性，变黄为阳性精氨酸双水解酶测定培养基蛋白胨 1 g 氯化钠 5 g 磷酸氢二钾0.3 g 琼脂 6 g 酚红0.01 g L-精氨酸10 g 10 g蒸馏水1000 ml除酚红外, 将其它成份加热溶解，调pH6.8～7.0。
按量加入酚红指示剂溶液，分装小试管。
15磅15分钟灭菌，置高层。
使用前表面需覆盖一层灭菌液体石蜡。
2．β-苯丙氨酸原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。
2、试验方法：从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1 ℃培养18~24h后，滴加10%三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。
如果立即出现绿色，为阳性，无色则为阴性。
应用：本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌鉴定。
变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌均为强阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。
DI－苯丙氨酸(或L－苯丙氨酸1g)2g3．卵黄反应卵磷脂酶试验。
将菌种点种于卵黄培养基（鸡蛋黄按比例加入营养琼脂），周围出现白色沉淀圈即是阳性。
如蜡样芽孢杆菌等。
培养基中加卵黄的比例不统一，有不同比例，但不影响结果判定。
原理：某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。
生化实验报告实验实验一考马斯亮蓝G-250 染色法测定蛋白质的含量（p24）一、目的要求掌握考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质含量原理和方法。
二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质─染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250 染料在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色。
在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm。
且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5 分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2 分钟即可完成，其颜色可以在1 小时内保持稳定，且在5 分钟至20 分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。
2. SOD 活力测定[1] 邻苯三酚自氧化率的测定取4.5ml 50mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml 蒸馏水和1ml 10mmol/L EDTA-Na 2溶液，混匀后在25℃水浴保温20分钟，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml ，迅速摇匀，倒入光径1cm 的比色杯内，用10mmol/L HCl 作空白，325nm 波长下每隔30秒钟测光吸收值一次，整个操作在4分钟内完成，计算出每分钟A 325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。
要求自氧化速率控制在0.070/min 左右。
[2] 酶活力测定操作与⑴基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD 样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
[3] 酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：样液体积样液稀释倍数反应液总体积数）（单位活性⨯⨯⨯-=%50%100/)/(00A A A ml U m其中，A 0：为邻苯三酚自氧化率；A m ：加酶后邻苯三酚自氧化率；总活性(U)＝单位活性×酶原液总体积 [4] 蛋白质含量测定考马斯亮蓝G-250法）：⑴ 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：试剂管号12 3 4 5 6 蛋白质标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝G-250(ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(ug)20406080100盖上塞子，摇匀。
注意各管振荡程度尽量一致。
放置10分钟，在595nm 波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。
以牛血清白蛋白含量（ug ）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
⑵ 样品中蛋白含量的测定将待测的SOD 溶解并稀释到一定浓度，取1支试管，准确加入0.1ml 样品提取液，加入0.9ml 蒸馏水和5ml 考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
1．火
（1）酒精及其它可溶于水的液体着火时，可用水灭火
（2）汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时，应用石棉布或砂土扑灭，绝对不能用水，否则反而会扩大燃烧面积。
（3）电起火，不能用水和二氧化碳灭火器，应切断电源或用四氯化碳灭火器。
2．烧伤
（1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。
（2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。
氨基酸的分离鉴定纸层析法
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层
析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大
小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量
和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨
基酸。
在操作过程中，手不要摸滤纸。
点样直径不超过3mm 。
点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。
即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。
蛋白质及氨基酸的呈色反应
双缩脲反应
紫红色肽键可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
茚三酮反应
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
黄色反应
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
坂口反应
与精氨酸反应呈红色，精氨酸是唯一呈此反应的氨基酸，反应极为灵敏
醋酸铅反应
蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱条件下，可分解形成硫化钠。
硫化钠和醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。
若加入浓盐酸，就生成有臭味的硫化氢气体。
蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱条件下，可分解形成硫化钠。
硫化钠和醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。
若加入浓盐酸，就生成有臭味的硫化氢气体。
蛋白质的等电点测定和沉淀反应
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液pH值称为此种蛋白质的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向缓冲液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点
蛋白质的沉淀反应
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀的反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
吸光度与蛋白质含量成正比。
灵敏度高，测定快速简便，干扰物质少。
微量凯氏定氮法
有机物与浓硫酸共热，有机氮转变为无机氮（氨），氨与硫酸作用生成硫酸氨，后者与强碱作用释放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液被中和的程度，即可计算出样品的含氮量。
中和程度用滴定法来判断，分回滴法和直接法两种。
（1）回滴法：用过量的标准酸吸收氨，其
剩余的酸可用标准NaOH滴定，由盐酸量减
去滴定所耗NaOH的量即为被吸收的氨之量。
此法采用甲基红做指示剂。
（2）直接法：用硼酸作为氨的吸收溶液，
结果使溶液中[H+]降低，混合指示剂（PH4.3
－5.4），黑紫色变为绿色。
再用标准酸来滴定，
使硼酸恢复到原来的氢离子浓度为止，指示
剂出来淡紫色为终点，此时所耗的盐酸量即
为氨的量。
样液：1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl液，并稀释至100ml。
如有不溶物，离心取上清液备用。
醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。
方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。
由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。
带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。
电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。
经洗脱比色观察不同蛋白质的区带。
1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。
点样后电泳槽一定要密闭。
电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。
2、缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。
因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。
3、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。
4、通电过程中，不准取出或放入薄膜。
通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。
酶的特性
温度对酶活力的影响
大多数动物酶的最适温度为37－40℃，植物酶的最适温度为50－60℃。
高温失活，低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
pH对酶活性的影响
唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。
唾液淀粉酶的活化和抑制
酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。
氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。
血糖的定量测定
动物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量较恒定。
用硫酸锌和氢氧化钠除去被检测血中的蛋白质制成无蛋白血滤液。
当将血滤液与标准铁氰化钾溶液共热时,一部分铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，并与锌离子生成不溶性化合物。
向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸钠溶液滴定所释放的碘。
即可知剩余的铁氰化钾量。
血糖越多，剩余的铁氰化钾越少，所消耗的硫代硫酸钠也越少。
硫代硫酸钠溶液用量与血糖的关系可以由经验确定下来的数字表查出。
对照组要多一些，且要先查表再相减
脂肪酸的β－氧化
样品中丙酮的含量= (V1-V2) x C Na2S2O3 x 1/6
V1—滴定对照所消耗的Na2S2O3 的体积
V2—滴定样品所消耗的Na2S2O3 的体积
C—Na2S2O3 的浓度
维生素C的定量测定2，6-二氯酚靛酚滴定法
用蓝色的碱性染料标准溶液,对含维生素C的酸性浸出液进行氧化还原滴定,染料被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色,如无其他干扰物质存在，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原性抗坏血酸量成正比。
过氧化物酶的作用
过氧化物酶能催化过氧化氢释出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质，例如氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙（橙红色）；氧化愈创木脂中的愈创木酸成为蓝色的愈创木酸的臭氧化物。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。
染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。
其他性质：荧光法。
一、凯氏定氮法：根据蛋白质的含氮量来测定蛋白质的含量
公式:每g样品中含氮克数×6.25 ×100
二、比色法：利用蛋白质与不同试剂的呈色反应，测定蛋白质的含量，如双缩尿法和酚试剂法（lowry’s method）。
三、紫外分光光度法：利用蛋白质对280nm紫外光有最大的吸光度而采用。
