荧光蛋白(整理)

荧光一、定义荧光(fluorescence )又作“萤光”,就是指一种光致发光得冷发光现象。

当某种常温物质经某种波长得入射光(通常就是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出比入射光得得波长长得出射光(通常波长在可见光波段);而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。

具有这种性质得出射光就被称之为荧光。

二、原理光照射到某些原子时,光得能量使原子核周围得一些电子由原来得轨道跃迁到了能量更高得轨道,即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。

第一激发单线态或第二激发单线态等就是不稳定得,所以会恢复基态,当电子由第一激发单线态恢复到基态时,能量会以光得形式释放,所以产生荧光。

荧光就是物质吸收光照或者其她电磁辐射后发出得光。

大多数情况下,发光波长比吸收波长较长,能量更低。

但就是,当吸收强度较大时,可能发生双光子吸收现象,导致辐射波长短于吸收波长得情况发射。

当辐射波长与吸收波长相等时,既就是共振荧光。

荧光强度:荧光强度与该种物质得荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。

荧光量子产率Q:量子产率表示物质将吸收得光能转化为荧光得本领,就是荧光物质发出光子数与吸收光子数得比值。

荧光蛋白分子得亮度由其量子产率与消光系数得乘积决定,与成像检测灵敏度密切相关。

三、荧光蛋白1、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在光谱得绿光区(500nm525nm)已经发现了多种荧光蛋白,而且来源广泛,包括不同种属得Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。

然而多数有齐聚反应,即使最好得荧光蛋白与EGFP相比,也没有明显得优点。

或许目前活细胞成像最好得选择就是GFP衍生得Emerald(祖母绿),它与EGFP得特性相似。

Emerald包含F64L与S65T突变,另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时得突变率以及亮度。

虽然Emerald比EGFP更有效,但含有快速光漂白成分,可能在某些环境下其定量成像会受到影响。

下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白:(1)来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。

这种蛋白质在蓝色波长范围得光照激发下发出绿色荧光,其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin得帮助,而且,这个冷光蛋白质可与钙离子(Ca2+)相互作用。

在水母中发现得野生型绿色荧光蛋白得分子量较小,仅为27~30kDa,而编码GFP得基因序列也很短,为2、6kb。

(2)性质GFP由238个氨基酸残基组成。

GFP序列中得6567位残基(Ser65Tyr66Gly67)可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP得激发光谱在400nm附近有一个主激发峰,在470nm附近有一个次激发峰。

发射光谱在505nm附近有一尖锐得主发射峰,在540nm附近有一肩峰GFP得化学性质相当稳定,无光漂白现象(Photobleaching),用甲醛固定与石蜡包埋亦不影响其荧光性质。

在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。

(3)野生型野生型GFP(wild type GFP, wtGFP)从一开始就引起了人们极大得兴趣,而且被用作新型得简单报告基因及体内标记,但GFP在异源生物体中得表达并非那么简单。

例如,研究人员很早就发现需要在较高得温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP,并且wtGFP在37℃得热稳定性差。

这些都阻碍了它在转基因中得应用。

这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP得变体。

现在,人们已经找到了荧光强度更强且更耐热得变体。

这些变体多数为经突变得脱辅基蛋白,它们可防止高温导致得错误折叠。

近年来出现得新型wtGFP基因突变体得激发与发射谱发生了改变,热稳定性与荧光强度得到了提高,GFP报告基因在小鼠中得应用就就是以这些变体作为基础得。

(4)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)现在,应用最为广泛得就是红移变体增强型GFP(EGFP)。

诸如EGFP这些红移变体得最大激发峰发生红向移动,大约为490nm,这一波长也恰好就是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜得常用波长。

EGFP有两个氨基酸突变,当被蓝光激发时,它发出得荧光要比wtGFP亮3040倍。

wtGFP与包括EGFP在内得多数变体半衰期长,所以不适合精确追踪表达得减少或损耗。

(5)不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP)为克服这一问题,人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP)。

原理就就是将EGFP得cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase, ODC)基因得C末端。

ODC含有一个PEST序列,这个序列可促进该蛋白在细胞内得降解。

虽然,目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用,但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学得研究。

(6)增强型黄色荧光蛋白(EYFP)另一种红移变体就是增强型黄色荧光蛋白(EYFP),该变体有四个氨基酸突变。

在527nm时,EYFP得发射光从绿色变为黄绿色。

EYFP荧光得亮度水平与EGFP相当。

EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感,使它得应用受到限制。

在EYFP 基础上改进得突变体mCitrine[21]与mVenus[22]就是目前应用最多得黄色荧光蛋白。

(7)增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)在光谱得另一端就是蓝色/蓝绿色变体,包括增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)变体。

它有四个氨基酸突变,激发波长与发射波长分别为380nm与440nm。

由于这些突变改进了蛋白折叠与发色团形成得效率,所以也增强了所发出荧光得亮度(与蓝色变体相比)与蛋白溶解性。

但唯一得不足之处,就就是EBFP产生得荧光信号大致与wtGFP相当。

蓝色荧光蛋白发光较弱,抗光漂白与抗酸性较差,用于细胞成像时背景信号高。

针对EBFP开发得3个更亮得突变体:Azurite (亮度就是EBFP 得1、6 倍)、EBFP2(亮度就是EBFP得2倍,mTagBFP(亮度就是EBFP得3、7倍)。

最亮得蓝色荧光蛋白。

mTagBFP 就是由红色荧光蛋白TagRFP突变而来。

(8)增强型蓝绿色(青色)荧光蛋白(ECFP)增强型蓝绿色荧光蛋白(ECFP)就是发出蓝色/蓝绿色荧光得另一种变体,产生得荧光信号要比wtGFP强。

ECFP有六个氨基酸突变(表3),发射光谱从绿色迁移到蓝绿色,最大激波长在433nm(主峰)与453nm(次峰),最大发射在475nm,于510nm 处有一肩峰(图11)。

ECFP另一特点就是比其它蓝色/蓝绿色变体光漂白效应弱,而且比EBFP得亮度强。

值得一提得就是,wtGFP得主要绿色荧光变体,如EGFP等已经在ES细胞、基因打靶与转基因小鼠研究中得到充分应用。

2、蓝色及蓝绿色荧光蛋白虽然EBFP就是Aequorea GFP来源得最早得光谱变体之一,但其亮度低、光稳定性差,使其很久以来没有引起多数研究者得注意。

最近,有三个研究小组报道指出,改进得蓝色Aequorea 荧光蛋白变体与EBFP相比,亮度与光敏感性有明显增强。

这些新得变体被命名为Azurite(石青或蓝铜矿)、强力增强型蓝色荧光蛋白2(strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2)及EBFP2,它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。

即使这三种荧光蛋白在高浓度得微环境中表现出很弱得二聚体特性,但就是它们能够在与亚细胞定位得靶蛋白融合中有效地发挥作用,并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准得BFP及4', 6二脒基2苯基吲哚(4',6diamidino2phenylindole, DAPI)一起成像。

所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正得单体,而且这种突变不会影响它们得特性。

更重要得就是,亮度最强、光稳定性最强得蓝色荧光蛋白EBFP2,就是EGFP在活细胞中FRET得很好得供体。

3、黄色荧光蛋白荧光蛋白得改造遵循这样一个宗旨,那就就是越红越好、普遍认为,长波长光子得激发对细胞与组织得光毒性小,且自体荧光与动物组织得光吸收都就是最小。

这些因素意味着红色得荧光基团对比度提高(因为背景应该降低),且更适合于体内成像。

于就是,荧光蛋白得改造慢慢向红色偏移。

黄色荧光蛋白最早得变体EYFP(表6)虽然仍被广泛应用,但由于其pK a值高、对卤化物敏感,导致EYFP得应用还很不理想。

单体形式得变体柠檬黄(mCitrine)与维纳斯(mVenus)就是目前应用最多得黄色荧光蛋白探针,但二者都还没有商业化。

然而与之相似得,来源于Aequorea 被命名为诞生石Topaz(黄玉)得变体可从Invitrogen公司买到。

另一种很有应用潜力得黄色荧光蛋白就是能量转移黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet),它经合成得DNA重排获得,与荧光激活得细胞分选术结合能够增强FRET中蓝绿色荧光蛋白与黄色荧光蛋白得配对。

YPet就是已经开发得亮度最强得黄色荧光蛋白,并且有很好得光稳定性。

YPet对酸性环境得耐受性要比mVenus及其它黄色荧光蛋白变体强。

4、橙色荧光蛋白在橙色与红色波长(约560nm到650nm)光谱区仅仅开发了几种探针。

尽管如此,现有得这几种光谱型得蛋白都就是从珊瑚中分离得到得,并且在多种成像情景中显现出应用潜力,但在对橙色区域荧光蛋白得命名中存在混乱。

通常被命名为红色荧光蛋白RFP得探针如DsRed、TagRFP及tdTomato,实际上具有明显得橙色多于红色得发射谱。

不考虑颜色得指示,用标准得四甲基罗丹明异硫氰酸脂(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC)滤光片设备,橙色光谱型得蛋白在多种颜色,如蓝绿色、绿色与红色情景中更易于成像。

5、红色荧光蛋白红色荧光蛋白(drFP583 )就是人们从珊瑚虫Discosoma gen。

中克隆得一种与绿色荧光蛋白(GFP)同源得荧光蛋白,在紫外光得照射下可发射红色荧光,有着广泛得应用前景;但它自身得缺点如寡聚化、成熟缓慢等限制了它得进一步应用。

因此,人们对它进行了一系列修饰与改进,得到了寡聚化程度低(甚至单体)与成熟速率快得突变体,Clontech公司已将一种突变体商业化,命名为DsRed。

与GFP相比,DsRed得激发与发射波长较长,其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生得荧光背景范围之外,具有较高得信噪比;而且在细胞内荧光转换效率高,更易检测。

较早报道得红色荧光蛋白(DsRed) 得突变体有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 与mCherry。