荧光蛋白(整理)
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荧光蛋白
Martin Chalfie
马丁-查尔菲展示了 绿色荧光蛋白作为 各种生物现象的亮 光基因标签的价值。
Roger Y Tsien
钱永健的巨大贡献在 于，他使科学从红到 蓝的颜色，并开发了 很多使用工具，这使 得绿色荧光蛋白技术 的应用非常简单。
相对分子质量小，对细胞无毒性 检测方便，可直接用于活体测定（只需紫外光或蓝光激发，即可
发出绿色荧光） 无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制 不受假阳性干扰，灵敏度高（由于其他生物本身不含有GFP，因
此不会出现假阳性结果）
GFP的改进
Heim等(1995)采用定点突变的方式，把 第65位丝氨酸换成苏氨酸或胱氨酸，荧 光强度提高了4～6倍。后来的研究中用 到的GFP突变体都是在此基础上通过改变 若干碱基而得到的。
一 GFP的研究历史
1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》 上报道，他们分离纯化了水母（Aequorea victoria）中发 光蛋白水母素。
1963年，下村修和约翰森在《科学》杂志报道钙和水母 素发光的关系。
Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创 造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分 子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法， 是目前仍用的方法之一。
1974年，下村修和约翰森纯化了绿色蛋 白，即以后的绿色荧光蛋白GFP。
Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可 以发生能量转移。水母素在钙刺激下发 光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 这是物理化学中知道的荧光共振能量转 移(FRET)在生物中的发现。
1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立 根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地 说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的 基因。
荧光蛋白发光综述
荧光蛋白及其发光原理介绍Xxx（xxxx xxxx xxx xxxxx）摘要本文介绍了荧光蛋白的来源，基本结构和发光机理，并通过与电子行业中广泛应用的无机固体发光材料进行比较，提出荧光蛋白可行的应用前景。
关键词：荧光蛋白，生色团，发光原理，应用前景1 引言自然界有许多生物能够发光。
多数生物发光过程是通过小分子有机化合物荧光素和荧光素酶的化学反应释放出光能。
然而有一类荧光物质不仅能在化学能激发下发出荧光，还能被光激发---荧光蛋白。
荧光蛋白种类很多，其中最有应用价值的是在最早在多管水母中提取的绿色荧光蛋白]1[。
绿色荧光蛋白化学性质稳定，分子量约27000，为238个氨基酸残基组成的单链结构。
在溶液中可形成二聚体或四聚体桶状晶体。
其荧光发射峰在509nm , 最大激发波长为395 nm , 并在470 nm 处有一肩峰。
由绿色荧光蛋白为蓝本通过基因技术合成的突变体发射光谱在整个可见光波段，因此在生物荧光标记方面得到广泛的应用，2008年诺贝尔化学奖也授予下俢村，钱永健等在此方面做出贡献的科学家。
2 绿色荧光蛋白基本结构绿色荧光蛋白分子呈圆柱桶状。
Yang 等]2[的研究表明, GFP是由两个相当规则的内含一个α2螺旋和外面包围11个β2折叠链的β2桶状结构组成的二聚体。
图1 绿色荧光蛋白结构蛋白质前端环化形成生色团。
生色团的结构可以人工改造，从而发出不同波长的荧光。
生色团一经形成其化学性质便十分稳定，又能通过桶装蛋白质外壳给予其足够的保护，只有遇到强化学或者温度环境时才会遭到破坏，而且还具有一定的自我恢复能力。
正是这样的特殊结构使得荧光蛋白具有稳定的发光能力。
图2 生色团环化形成示意图如图所示，蛋白质二聚体端基环化氧化后能够发生质子化以及顺-反异构变化]3[，因此导致分子能级发生变化，具有发光能力。
生色团在蓝光照射下，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。
利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。
荧光蛋白 (整理)
荧光一、定义荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
二、原理光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。
第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。
荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。
大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。
但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。
当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。
荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。
荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。
荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。
三、荧光蛋白1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。
然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。
或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。
Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。
虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。
荧光蛋白
பைடு நூலகம்
要进一步研究还存在一定局限性: （1）荧光信号强度的非线性性质使得定量非 常困难 （2）多数生物具有微弱的自发荧光现象，并 有着类似的激发和发射波长，这个荧光背景会影 响某些 GFP 的检测， （3）实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株， 可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关， （4）另外，需要注意，由于GFP本身分子量较 大，以融合蛋白形式表达的GFP有可能对蛋白本身 的细胞定位等特性产生影响，在使用 GFP作为标 签时需要进行仔细分析。
GFP还可用于监控生物体内的各种生物 现象，例如基因表达、蛋白质定位和动力 学、细胞分化、染色体复制和调控、细胞 内转运途径等。现在科学家们仍在继续寻 找新的荧光蛋白基因，使得被荧光蛋白标 记的蛋白质不仅可以发绿光、黄光、橙光， 还可以发红光。众多的荧光蛋白基因构建， 以及基因表达技术的开发应用，必然会给 分子生物学研究注入新的活力，给相关领 域的研究带来新气象。
3．融合抗体：近年来，关于绿色荧光蛋白融 合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如 将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并 导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因 融合抗体具有与抗原结 合及发射荧光两种特性 ，故这一人工子可用做 免疫染色的检测试剂， 直接应用于流式细胞仪 和免疫荧光的标记及肿 瘤的检测等等。
20世纪60年代，一位日本科学家从 美国西岸打捞了大量发光水母，带回位 于华盛顿州的实验室进行研究，这些水 母在受到外界的惊扰时会发出绿色的荧 光。经过长期的重复努力，发现在这种 水母的体内有一种叫水母素的物质，在 与钙离子结合时会发出蓝光，而这道蓝 光未经人所见就已被一种蛋白质吸收， 改发绿色的荧光。
这种捕获蓝光并发 出绿光的蛋白质，就是 绿色荧光蛋白。这位日 本科学家也因为这项发 现，获得了2008年颁发 的诺贝尔化学奖，他就 是日本科学家下村修。
要进一步研究还存在一定局限性: （1）荧光信号强度的非线性性质使得定量非 常困难 （2）多数生物具有微弱的自发荧光现象，并 有着类似的激发和发射波长，这个荧光背景会影 响某些 GFP 的检测， （3）实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株， 可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关， （4）另外，需要注意，由于GFP本身分子量较 大，以融合蛋白形式表达的GFP有可能对蛋白本身 的细胞定位等特性产生影响，在使用 GFP作为标 签时需要进行仔细分析。
GFP还可用于监控生物体内的各种生物 现象，例如基因表达、蛋白质定位和动力 学、细胞分化、染色体复制和调控、细胞 内转运途径等。现在科学家们仍在继续寻 找新的荧光蛋白基因，使得被荧光蛋白标 记的蛋白质不仅可以发绿光、黄光、橙光， 还可以发红光。众多的荧光蛋白基因构建， 以及基因表达技术的开发应用，必然会给 分子生物学研究注入新的活力，给相关领 域的研究带来新气象。
3．融合抗体：近年来，关于绿色荧光蛋白融 合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如 将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并 导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因 融合抗体具有与抗原结 合及发射荧光两种特性 ，故这一人工子可用做 免疫染色的检测试剂， 直接应用于流式细胞仪 和免疫荧光的标记及肿 瘤的检测等等。
20世纪60年代，一位日本科学家从 美国西岸打捞了大量发光水母，带回位 于华盛顿州的实验室进行研究，这些水 母在受到外界的惊扰时会发出绿色的荧 光。经过长期的重复努力，发现在这种 水母的体内有一种叫水母素的物质，在 与钙离子结合时会发出蓝光，而这道蓝 光未经人所见就已被一种蛋白质吸收， 改发绿色的荧光。
这种捕获蓝光并发 出绿光的蛋白质，就是 绿色荧光蛋白。这位日 本科学家也因为这项发 现，获得了2008年颁发 的诺贝尔化学奖，他就 是日本科学家下村修。
多种荧光蛋白
多种荧光蛋白荧光蛋白是一种广泛应用于生物学研究的蛋白质，它们能够发出绿色、黄色、橙色、红色等不同颜色的荧光，被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。
本文将按照荧光蛋白的类别进行介绍。
1. 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（GFP）是最早被发现的荧光蛋白，它能够发出绿色荧光。
GFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。
GFP的应用范围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。
2. 黄色荧光蛋白黄色荧光蛋白（YFP）是一种能够发出黄色荧光的荧光蛋白，它是GFP的变种。
YFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。
YFP的应用范围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。
3. 橙色荧光蛋白橙色荧光蛋白（OFP）是一种能够发出橙色荧光的荧光蛋白，它是GFP的变种。
OFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。
OFP的应用范围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。
4. 红色荧光蛋白红色荧光蛋白（RFP）是一种能够发出红色荧光的荧光蛋白，它是GFP的变种。
RFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。
RFP的应用范围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。
总结荧光蛋白是一种广泛应用于生物学研究的蛋白质，它们能够发出绿色、黄色、橙色、红色等不同颜色的荧光。
不同颜色的荧光蛋白在生物学研究中有着不同的应用，它们可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。
荧光蛋白的应用范围非常广泛，它们被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。
荧光蛋白 (整理)
荧光一、定义荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
二、原理光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。
第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。
荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。
大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。
但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。
当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。
荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。
荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。
荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。
三、荧光蛋白1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。
然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。
或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。
Emerald包含F64L和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。
虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。
荧光蛋白bfp的常用的激发光和发射光光谱_概述说明
荧光蛋白bfp的常用的激发光和发射光光谱概述说明1. 引言1.1 概述激发光和发射光谱是荧光蛋白BFP（Blue fluorescent protein）研究中的重要内容。
荧光蛋白BFP是一种能发出蓝色荧光的蛋白质，在生物医学和生物工程领域有广泛的应用。
了解荧光蛋白BFP的激发光和发射光谱特征对于深入理解其结构、功能以及应用具有重要意义。
1.2 文章结构本文将从以下几个方面介绍荧光蛋白BFP的激发光和发射光谱特征：首先，我们将简要介绍荧光蛋白BFP的基本信息和应用背景；然后，我们将详细分析其常见的激发光源及其选择原则；接下来，我们将探讨影响激发光谱特征的因素，并对其进行深入研究；之后，我们将对荧光蛋白BFP的发射峰和光谱特性展开分析；最后，我们将总结主要观点和结果，并提出未来研究建议和展望。
1.3 目的本文的目的是全面概述荧光蛋白BFP的常用的激发光和发射光谱特征。
通过对激发光谱和发射光谱的研究，我们可以深入了解荧光蛋白BFP在不同条件下的发色机制，并为其在生物医学与生物工程领域中更广泛的应用提供基础研究支持。
同时，本文也旨在提供给科研人员参考，在实验设计和数据分析时能够更好地使用荧光蛋白BFP并理解其特性。
2. 荧光蛋白BFP2.1 荧光蛋白简介荧光蛋白（Fluorescent protein, FP）是一类生物荧光探针，具有自身固有的发光性质。
其中，荧光蛋白bfp (Blue Fluorescent Protein)是一种产生蓝色荧光的变种。
2.2 BFP的特点和应用荧光蛋白bfp具有以下几个特点：首先，bfp能够在体内及细胞内表达，不需要添加外部试剂。
其次，bfp具有很高的相对分子量、热稳定性和耐酸碱性，使其在不同环境条件下都能保持良好的发光性能。
此外，bfp拥有较窄的激发峰和发射峰，在实验中可以通过滤波器和单色仪轻松地检测到其发出的荧光信号。
最后，bfp与其他颜色的荧光蛋白（如GFP、YFP等）相比，具有更快的亮灭动力学与较高的亮度。
荧光蛋白
1
荧光蛋白的发展简史
2
荧光蛋白的结构
3
荧光蛋白的分类
4
荧光蛋白的应用
5
结 论 与 展 望
下村修
• 1962年在维多利亚多管水母体内 发现了绿色荧光蛋白( GFP )，并 进行纯化。
马丁·沙尔菲
• 第一次运用绿色荧光蛋白 这个神奇工具投入试验研 究。
钱永健
• 1994年，改造GFP，使 其荧光变强、变色。
图2.Azurite突变体 图3. EBFP2 突变体
荧光蛋白的应用
• 红色系列荧光蛋白
对于橙色与红色系列荧光蛋白，较早报道的红色荧光蛋白(DsRed)的突变体有 mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。这些以水 果命名的荧光蛋白表现出不同的光谱和理化特性，其中红色荧光蛋白mCherry 成熟 快、单体特性好，已被广泛应用，但它的亮度较低。
mKeima 是最早报道的大 Stokes 位移的红色荧光蛋白， 它的发射与吸收峰分别位于440 和620 nm 处。采用458 nm 的光 源同时激发CFP 与 mKeima 两个 荧光分子，能实现单光源的多色 成像及荧光相关光谱(FCS) 分析。 但 mKeima 有两个激发峰，另一 个在584 nm 处，这不利于它的 多色成像。
图8. PA-GFP的CLSM
图9. Dronpa 光致变色的性质
结论与展望
结论
本文主要介绍了荧光 蛋白的发展，结构及 分类，以及其在亮度、 Stokes 位移、光谱等 特性方面的研究与发 展，在光转换与光激 活荧光蛋白及其在超 分辨荧光成像技术中 的应用。
展望
活体成像深度仍有局 限性，为了提高分辨率， 需要优化出更合适于活 体荧光成像的高亮度近 红外荧光蛋白分子。 新型光学成像技术迫 切需要具备新特性的荧 光分子与之结合，以更 大程度地提高成像的时 空分辨率和检测灵敏度。
荧光蛋白的发展简史
2
荧光蛋白的结构
3
荧光蛋白的分类
4
荧光蛋白的应用
5
结 论 与 展 望
下村修
• 1962年在维多利亚多管水母体内 发现了绿色荧光蛋白( GFP )，并 进行纯化。
马丁·沙尔菲
• 第一次运用绿色荧光蛋白 这个神奇工具投入试验研 究。
钱永健
• 1994年，改造GFP，使 其荧光变强、变色。
图2.Azurite突变体 图3. EBFP2 突变体
荧光蛋白的应用
• 红色系列荧光蛋白
对于橙色与红色系列荧光蛋白，较早报道的红色荧光蛋白(DsRed)的突变体有 mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。这些以水 果命名的荧光蛋白表现出不同的光谱和理化特性，其中红色荧光蛋白mCherry 成熟 快、单体特性好，已被广泛应用，但它的亮度较低。
mKeima 是最早报道的大 Stokes 位移的红色荧光蛋白， 它的发射与吸收峰分别位于440 和620 nm 处。采用458 nm 的光 源同时激发CFP 与 mKeima 两个 荧光分子，能实现单光源的多色 成像及荧光相关光谱(FCS) 分析。 但 mKeima 有两个激发峰，另一 个在584 nm 处，这不利于它的 多色成像。
图8. PA-GFP的CLSM
图9. Dronpa 光致变色的性质
结论与展望
结论
本文主要介绍了荧光 蛋白的发展，结构及 分类，以及其在亮度、 Stokes 位移、光谱等 特性方面的研究与发 展，在光转换与光激 活荧光蛋白及其在超 分辨荧光成像技术中 的应用。
展望
活体成像深度仍有局 限性，为了提高分辨率， 需要优化出更合适于活 体荧光成像的高亮度近 红外荧光蛋白分子。 新型光学成像技术迫 切需要具备新特性的荧 光分子与之结合，以更 大程度地提高成像的时 空分辨率和检测灵敏度。
荧光蛋白发光综述
荧光蛋白发光综述概述荧光蛋白（Fluorescent Protein，简称FP）是一类广泛存在于自然界中的蛋白质分子，是生物体内发光的重要成分。
荧光蛋白因其出色的荧光特性，使其在生物体内作为标记分子被广泛应用于生物成像、生物传感等领域。
本篇文档旨在对荧光蛋白发光的相关原理、特性、应用进行综述。
荧光蛋白发光原理荧光蛋白的发光原理来源于其结构上不寻常的芳香族氨基酸残基，即苯环类物质的氧化形成内酰胺环（chromophore）的化学反应过程。
当荧光蛋白被紫外线或蓝光激发时，荧光蛋白内的染色体蛋白分子发生结构变化，使内酰胺环从原来的蓝黄色变成绿色的荧光，从而发生发光现象。
荧光蛋白的特性荧光蛋白具有以下特性：1.光谱性质分布广泛。
荧光蛋白可以通过改变其结构或化学性质来改变其发光的光谱性质，以适应不同种类的生物体内标记。
2.发光强度高。
荧光蛋白发光强度高，因此可以在低浓度下进行检测。
3.可以与其他分子结合。
荧光蛋白可以与其他分子结合，如酶、抗体等，以达到定位、观察等目的。
4.双光子吸收。
荧光蛋白可通过双光子吸收技术，在低波长激发条件下发射绿色荧光，克服了普通荧光染料激发强度过低等问题。
荧光蛋白在生物标记和成像中的应用荧光蛋白因为其特殊的化学结构和强的荧光特性，被广泛应用于生物标记和成像的领域中。
通过利用荧光蛋白将其连接到所需生物物质上，可以进行细胞、组织和器官在生理活动、发育、病理变化中的追踪和观察，同时荧光蛋白还可以用于微量、高通量的系统生物学中。
极大地促进了相关领域的发展。
荧光蛋白因其独特的结构以及优异的荧光特性而被广泛研究和应用。
作为生物标记和成像领域的重要组成部分，荧光蛋白的应用将在未来继续得到广泛的推广和研究。
简述荧光蛋白
简述荧光蛋白王裕鹏（海南省洋浦经济开发区洋浦中学洋浦578000）摘要荧光蛋白的发现为生命科学研究提供了极为有效的方法，具有划时代的意义。
本文就荧光蛋白的发现、分类、理化性质和基本应用进行归纳总结。
关键词荧光蛋白生色团荧光标记蛋白质互作染色和标记是细胞生物学研究常用方法。
早在荧光蛋白发现之前,免疫偶联荧光标记、化学荧光染料直接标记等技术已广泛应用于生物分子的研究中。
而荧光蛋白的发现及后续改造，为生命科学基础研究提供了更为完善和系统的标记工具，为探索活细胞中微观生命的活动规律创造了机会，推动了人们对生命4步的认识。
1荧光蛋白的发现及分类1.1绿色荧光蛋白1962年,下村修从维多利亚多管水母中分离到一种蛋白，在紫外线激发下它可以发出绿色荧光，即绿色荧光蛋白（GFP）⑴。
他还采用生物化学方法初步推测了GFP的发光位点和发光基团⑵。
普拉舍于1985至1992年间完成了GFP基因和蛋白质序列的测定，并确定了发光位点⑶。
随后科学家解析了GFP的晶体结构⑷。
首次将GFP应用于生物学研究的是马丁•查尔菲，他通过分子生物学技术将GFP的cDNA在线虫等模式生物中表达〔列，使人们意识到GFP作为报告基因的巨大潜力。
钱永健团队解析了GFP的发光机制〔句，并通过突变对GFP改造,得到了一些荧光亮度更高、吸收峰单一、构象折叠效率高的突变体，如GFP-S65T[7]o为了表彰他们在绿色荧光蛋白研究中做出的巨大贡献,2008年诺贝尔化学奖授予了下村修、马丁•查尔菲和钱永健三位科学家。
1.2红色荧光蛋白1999年,Matz等从珊瑚虫中分离出了能在紫外照射下发出红色荧光的蛋白质——红色荧光蛋白（RFP）[8]O其中，DsRed是最早用于研究的红色荧光蛋白，2001年Yarbrough等人解析了它的晶体结构叫相比于GFP,它有更高的荧光强度，成像背景低，并能激发和发射更长的波长。
很多时候，研究者可同时使用GFP和DsRed对不同蛋白质进行双标记可完成GFP无法独自解决的问题。
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荧光一、定义荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
二、原理光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。
第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。
荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。
大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。
但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。
当辐射波长与吸收波长相等时，既是共荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。
荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。
荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。
三、荧光蛋白1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP ）在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。
然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。
或许目前活细胞成像最好的选择是GFP 衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。
Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。
虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。
下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白：（1）来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。
这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。
在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb 。
（2）性质GFP由238个氨基酸残基组成。
GFP序列中的65-67 位残基（Ser65-Tyr66-Gly67 ）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。
发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching ），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。
（3）野生型野生型GFP（wild type GFP, wtGFP ）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。
例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。
这些都阻碍了它在转基因中的应用。
这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。
现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。
这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。
近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。
（4）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP （EGFP）。
诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。
EGFP有两个氨基酸突变，当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40 倍。
wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。
（5）不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。
原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。
ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。
虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。
（6）增强型黄色荧光蛋白（EYFP）另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白（EYFP），该变体有四个氨基酸突变。
在527nm时，EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。
EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。
EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感，使它的应用受到限制。
在EYFP 基础上改进的突变体mCitrine[21] 和mVenus[22]是目前应用最多的黄色荧光蛋白。
（7）增强型蓝色荧光蛋白（EBFP）在光谱的另一端是蓝色/ 蓝绿色变体，包括增强型蓝色荧光蛋白（EBFP）变体。
它有四个氨基酸突变，激发波长和发射波长分别为380nm和440nm。
由于这些突变改进了蛋白折叠和发色团形成的效率，所以也增强了所发出荧光的亮度（与蓝色变体相比）和蛋白溶解性。
但唯一的不足之处，就是EBFP产生的荧光信号大致与wtGFP相当。
蓝色荧光蛋白发光较弱，抗光漂白和抗酸性较差，用于细胞成像时背景信号高。
针对EBFP开发的3个更亮的突变体：Azurite （亮度是EBFP 的1.6 倍）、EBFP2（亮度是EBFP的2倍，mTagBFP亮（度是EBFP的3.7 倍）。
最亮的蓝色荧光蛋白。
mTagBFP是由红色荧光蛋白TagRFP突变而来。
（8）增强型蓝绿色（青色）荧光蛋白（ECFP）增强型蓝绿色荧光蛋白（ECFP）是发出蓝色/ 蓝绿色荧光的另一种变体，产生的荧光信号要比wtGFP强。
ECFP有六个氨基酸突变（表3），发射光谱从绿色迁移到蓝绿色，最大激波长在433nm（主峰）和453nm（次峰），最大发射在475nm，于510nm处有一肩峰（图11）。
ECFP另一特点是比其它蓝色/ 蓝绿色变体光漂白效应弱，而且比EBFP的亮度强。
值得一提的是，wtGFP的主要绿色荧光变体，如EGFP等已经在ES 细胞、基因打靶和转基因小鼠研究中得到充分应用。
2、蓝色及蓝绿色荧光蛋白虽然EBFP是Aequorea GFP来源的最早的光谱变体之一，但其亮度低、光稳定性差，使其很久以来没有引起多数研究者的注意。
最近，有三个研究小组报道指出，改进的蓝色Aequorea 荧光蛋白变体与EBFP相比，亮度和光敏感性有明显增强。
这些新的变体被命名为Azurite （石青或蓝铜矿）、强力增强型蓝色荧光蛋白2 （strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2 ）及EBFP2，它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。
即使这三种荧光蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性，但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发挥作用，并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的BFP及4', 6-二脒基-2- 苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）一起成像。
所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正的单体，而且这种突变不会影响它们的特性。
更重要的是，亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白EBFP2，是EGFP在活细胞中FRET的很好的供体。
3、黄色荧光蛋白荧光蛋白的改造遵循这样一个宗旨，那就是越红越好. 普遍认为，长波长光子的激发对细胞和组织的光毒性小，且自体荧光和动物组织的光吸收都是最小。
这些因素意味着红色的荧光基团对比度提高（因为背景应该降低），且更适合于体内成像。
于是，荧光蛋白的改造慢慢向红色偏移。
黄色荧光蛋白最早的变体EYFP（表6）虽然仍被广泛应用，但由于其pK a 值高、对卤化物敏感，导致EYFP的应用还很不理想。
单体形式的变体柠檬黄（mCitrine ）和维纳斯（mVenus）是目前应用最多的黄色荧光蛋白探针，但二者都还没有商业化。
然而与之相似的，来源于Aequorea 被命名为诞生石Topaz（黄玉）的变体可从Invitrogen 公司买到。
另一种很有应用潜力的黄色荧光蛋白是能量转移黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet），它经合成的DNA重排获得，与荧光激活的细胞分选术结合能够增强FRET中蓝绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的配对。
YPet 是已经开发的亮度最强的黄色荧光蛋白，并且有很好的光稳定性。
YPet 对酸性环境的耐受性要比mVenus及其它黄色荧光蛋白变体强。
4、橙色荧光蛋白在橙色和红色波长（约560nm到650nm）光谱区仅仅开发了几种探针。
尽管如此，现有的这几种光谱型的蛋白都是从珊瑚中分离得到的，并且在多种成像情景中显现出应用潜力，但在对橙色区域荧光蛋白的命名中存在混乱。
通常被命名为红色荧光蛋白RFP的探针如DsRed、TagRFP及tdTomato ，实际上具有明显的橙色多于红色的发射谱。
不考虑颜色的指示，用标准的四甲基罗丹明异硫氰酸脂（tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC ）滤光片设备，橙色光谱型的蛋白在多种颜色，如蓝绿色、绿色和红色情景中更易于成像。
5、红色荧光蛋白红色荧光蛋白（drFP583 ）是人们从珊瑚虫Discosoma gen 。
中克隆的一种与绿色荧光蛋白（GFP）同源的荧光蛋白，在紫外光的照射下可发射红色荧光，有着广泛的应用前景; 但它自身的缺点如寡聚化、成熟缓慢等限制了它的进一步应用。
因此，人们对它进行了一系列修饰和改进，得到了寡聚化程度低（甚至单体）和成熟速率快的突变体，Clontech 公司已将一种突变体商业化，命名为DsRed。
与GFP 相比，DsRed的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比; 而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。
较早报道的红色荧光蛋白（DsRed）的突变体有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和mCherry。