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绿⾊荧光蛋⽩绿⾊荧光蛋⽩（GFP）的转化表达及免疫印迹检测王媛0811142南开⼤学⽣命科学学院⽣物技术08级⼀、摘要：本实验利⽤酶切⽅法检测载体中所含GFP⽚段后，通过转化的⽅法把绿⾊荧光蛋⽩（GFP）外源基因转⼊⼤肠杆菌进⾏表达，通过免疫印记杂交⽅法（western blotting）分析GFP在⼤肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜⾊亮丽的绿⾊荧光蛋⽩。
关键词：绿⾊荧光蛋⽩免疫印记杂交⼆、引⾔：绿⾊荧光蛋⽩是⼀种源于⽔母(Aequorea Victoria)等海洋⽆脊椎动物的蛋⽩，分⼦量为26.9KD。
GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。
GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发⾊基团，⽆需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。
GFP能在不同的细胞内稳定表达，⽆种属、组织和位置特异性，对细胞⽆毒性且检测⽅法简单，将其作为报告基因已⼴泛应⽤于细胞⽣物学和分⼦⽣物学领域。
免疫印记⼜称蛋⽩质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的⼀种免疫检测技术。
其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋⽩质向阳极转移，即膜侧连接阳极或⾯向阳极，从⽽将电泳分离的蛋⽩从凝胶转移⾄固相载体上。
三、实验材料、仪器及⽅法：3.1 实验材料3.1.1 菌种E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21(pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株3.1.2 试剂与材料LB培养基（⾃⼰配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5%A.P.S 质粒⼩量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸3.1.3 仪器紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半⼲式蛋⽩质印迹电转移系统等。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白的原核表达和纯化及鉴定的实验设计与实践王青松;胡晓倩【摘要】该文以绿色荧光蛋白FRP为实验对象,通过设计原核蛋白表达、镍柱亲和纯化、荧光光谱分析、SDSPAGE电泳分离、Western blotting免疫印迹及蛋白质质谱鉴定等内容的生物化学综合实验,提高学生的生物化学实验技能.荧光光谱分析表明,纯化的GFP蛋白的最大激发波长为480 nm,最大发射波长为500 nm,与已知的GFP荧光光谱基本相同.SDSPAGE电泳分离发现,GFP的亲和纯化效果好,且纯化得到的GFP分子量约为27 kDa,与理论值相符.该实验适用于生物科学专业本科生系统完整地学习蛋白质表达、纯化和鉴定的实验方法,具有很好的综合性,取得非常好的教学效果.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2014(031)005【总页数】4页(P38-41)【关键词】绿色荧光蛋白;亲和纯化;SDS-PAGE电泳;Western blotting;LC-MS/MS质谱【作者】王青松;胡晓倩【作者单位】北京大学生命科学学院生物基础教学实验中心,北京100871;北京大学生命科学学院生物基础教学实验中心,北京100871【正文语种】中文【中图分类】Q-331绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一种在美国西北海岸生长的名为Aequorea victoria的维多利亚水母中发现的蛋白质。
GFP全长共238个氨基酸，分子量约为27kDa，它的发光核心是由第65至67个氨基酸（丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸）残基组成的结构域，可自发地形成一种荧光发色团，在波长395 nm的紫外光激发下可产生绿色荧光［1－4］。
自1962年日裔科学家下村修在维多利亚水母中发现绿色荧光蛋白至今，GFP已经广泛应用于蛋白质表达纯化、蛋白质相互作用、蛋白质细胞内定位示踪和模式生物转基因等生物学研究中［5－8］。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）对蛋白质进行电泳分离，是生物学研究中广泛使用的实验技术。
绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白.当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由3 个外显子组成，长2。
6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65—67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验一质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法:碱裂解法。
该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。
二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外,能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。
质粒DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。
在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。
石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
分子生物学实验设计彭杰2012141241104 摘要：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是源于海洋生物多管水母属（aequoia victoria）的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达,本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒纯化质粒,采用氯化钙法将工程菌DH5a制成感受态细胞,然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中,使得工程菌DH5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,并表达绿色荧光蛋白,接种于加氨苄青霉素的LB培养基上,筛选阳性克隆。
实验目的：获取发绿色荧光的大肠杆菌BL21实验材料：（一）仪器1、恒温摇床2、低温离心机3、恒温水浴4、超净工作台5、隔水式培养箱6、琼脂糖凝胶电泳仪系统7、台式高速离心机8、凝胶成像系统（Dark Reader）9、高压灭菌锅 10、10、100、1000μL微量移液器各一支11、制冰机 12、恒温培养箱13、PCR热循环仪 14、漩涡混合器（二）材料1、少量含pEGFP-N3和pET-28a质粒的菌液2、限制酶Bam HⅠ5'⋯G↓GATCC ⋯3' →5'⋯G GATCC⋯3'3'⋯CCTAG↑G ⋯5' →3'⋯CCTAG G⋯5'3、限制酶Not I 5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯5'4、0.2mL EP管架5、1.5ml塑料离心管6、一次性手套7、大肠杆菌DH2a和BL218、氯化钙氢氧化钠乙醇氯仿蔗糖硼酸9、乙二胺四乙酸（EDTA）10、三羟甲基氨基甲烷(Tris)11、氨苄青霉素12、溴酚蓝13、PCR产物快速胶回收试剂盒14、dNTP混合物15、引物对（正反向引物）16、Ex-Taq酶 T4DNA连接酶17、酵母提取物胰蛋白胨氯化钠18、小指管、吸头、培养皿、三角瓶、试管等（三）试剂·1、LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
2、实验步骤2.1 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。
（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。
（3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min 离心5 min。
弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。
（4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。
2.2 感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。
（2）加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
（3）42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
（4）加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095）一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。
为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果二、主要路线：1、质粒DNA的提取2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA3、酶切连接重组质粒4、重组质粒的扩增5、菌落PCR法鉴定阳性克隆6、目的荧光蛋白基因的表达1、质粒DNA的提取实验原理：1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
绿色荧光蛋白在原核生物中的表达一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。
2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。
3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。
二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA 片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP 基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。
再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。
将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三．仪器设备超净工作台、PCR仪、核酸电泳设备、灭菌锅、培养箱、恒温摇床、微量移液器、核酸蛋白图像分析仪、离心干燥仪、低温离心机、常温台式离心机、微量分光光度计、水浴锅、微波炉、金属浴、涡旋仪、掌中宝离心机等四．实验试剂质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、高效感受态制备试剂盒、T4连接酶、NheI、XhoI、Taq酶、氨苄青霉素（Amp）、IPTG、Goldview、核酸分子量标准、核酸电泳试剂、细菌培养用培养基五．实验菌株载体及引物大肠杆菌BL21.表达载体PET23bPET23BgfpfPET23BgfprT7Pomotor PrimerT7 Terminnator Primer第一天一、实验药品的配制：LB培养基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L；酵母提取物(Y east extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 5g/L另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4，固体培养基加入琼脂粉20g/L 。
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095）一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。
为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果二、主要路线：1、质粒DNA的提取2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA3、酶切连接重组质粒4、重组质粒的扩增5、菌落PCR法鉴定阳性克隆6、目的荧光蛋白基因的表达1、质粒DNA的提取实验原理：1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。
它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。
碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。
3）。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液或ddH2O中。
●实验目的掌握碱法抽提质粒DNA的原理和方法●实验仪器、材料、试剂1、仪器恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器。
2、材料：含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）⏹LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。
⏹溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ⏹氨苄青霉素(50mg/mL)⏹抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。
平衡酚密度大，可是DNA 在上清中。
异戊醇防止抽提液起泡。
⏹无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。
⏹70%乙醇作用：纯化质粒DNA。
⏹TE缓冲液或ddH2O 作用：溶解DNA●详细步骤1.1质粒扩增在含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α平板菌落上挑取单菌落，分别接种于液体培养基中（加氨苄青霉素40μg/mL），180 r/min振荡培养过夜。
1.2碱裂解法提取质粒1）取各培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液。
2）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。
3）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。
4）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。
5）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中。
6）向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中。
7）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm ×2min ,取上清液于新离心管中。
8）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置1h。
9）12000rpm ×5 min，倒去上清液，吸干液体。
10）加800μL70%乙醇，离心12000rpm ×1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味。
11）加20μL ddH2O（二次蒸馏水），混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-20℃保存备用。
实验结果预测：加入溶液1浑浊；加入溶液2变澄清；加入溶液3出现白色絮状沉淀；加入氯仿抽提溶液分层若成功提取，需琼脂糖凝胶电泳检测之后才能观察出结果。
2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA●实验原理质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。
电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
●实验目的检验是否获得所需的质粒●实验用品1、仪器电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。
2、材料：提取的质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。
3、试剂：Gold view（DNA染料）1×TAE缓冲液上样缓冲液（6×）●详细步骤2.1琼脂糖凝胶板制备1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
2）待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。
静置30min 左右，轻轻晃动拔出梳子。
2.2加样胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。
2.3电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。
2.4观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
2.5注意事项1.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
2.用移液枪将样品加至点样孔，吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。
3.电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。
注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。
3、酶切连接重组质粒实验原理1）生物体内能识别并切割特意的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
由于这种切割作用是在分子内部进行的，故名限制性内切酶2）Bam HⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯G↓GATCC⋯3'→5'⋯G GATCC⋯⋯3'3'⋯CCTAG↑G⋯5→3'⋯CCTAG G⋯⋯5'Not I切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯⋯53）双酶切重组质粒●实验试剂1 材料：实验一提取的质粒pEGFP- N3和pET--28a，0.2ml管，取液器吸头，一次性手套2 试剂：Not I, Bam HI, ddH2O，10×buffer，引物、琼脂糖，Gold view3 设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱●实验步骤3.1分别取两支0.2mlEP管做上标记：如①②3.3 将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h。
3.4 取5uL①②EP管的酶切反应液，同时取5uL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。
3.5 按照回收试剂盒（OMEGA）步骤切胶回收所需酶切产物片段。
1）需进行回收的凝胶，必须在新鲜的TAE缓冲液中进行电泳2）取一个灭菌1.5mlEP管称重记录其重量3）电泳结束后，凝胶成像系统中观察目的条带所在位置，用干净锋利的解剖刀切割所需回收的DNA条带（尽量不要切到多余的凝胶），放入已称重EP管后再次称重，计算得到凝胶重量。
4）按照1g凝胶加入1ml Binging Buffer（XP2）计算，若是0.3g则加入0.3ml Binging Buffer（XP2），总体积最好不要超过700ul。
5）装有凝胶的EP管置于55-60℃水浴锅温浴10min，期间不时摇晃直至凝胶完全溶解。
6）取一个HiBind DNA column 放置于2ml collection tube中，把已溶解的胶液添加到HiBind DNA column 中，室温下10000×g离心1min。
若胶液超过700ul，请分成同等的两份，分别加入两个HiBind DNA column。
