呼出气冷凝液检测在呼吸系统疾病中的应用_张弘

作者单位:100730中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院呼吸内科呼出气冷凝液检测在呼吸系统疾病中的应用张 弘 综述 蔡柏蔷 审校 =摘 要> 呼出气冷凝液(exhaledbreathcondensate,EBC)检查为新的呼吸道炎症状态检测方法。气道内衬液体中抗氧化物、可溶性标记物等多种生化分子,平静呼吸时可随气体呼出,遇冷则随水蒸气凝结而进入EBC。EBC中某些成分的显著异常,可反映哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫综合征、肺间质疾病等肺内及气道内氧化应激、炎症状态的变化及程度。EBC与传统方法如诱导痰、支气管镜肺泡灌洗液等相比,具有实时、无创、简单、可多次重复等特点,结果也有可比性。目前EBC检测尚属探索阶段,但随着检测技术的提高和了解的深入,EBC检测在未来会有广泛的前景。=关键词> 呼出气冷凝液;呼吸系统疾病;诊断 气道内衬液体中含有抗氧化物、可溶性标记物等多种生化分子,构成了肺组织抵御环境中吸入性氧化物(香烟烟雾、臭氧、氮氧化合物)及过敏原、微生物感染的屏障。这些生化分子的变化可反映氧化损伤、炎症以及相应治疗导致气道内环境的变化,故可用于监测疾病的变化。但是如何采集标本以准确反映气道炎症状态及治疗前后的变化,一直是呼吸系统疾病诊治过程中的难题。既往传统的方法包括痰液收集、诱导痰以及支气管镜肺泡灌洗液(BALF),但这些检查都有明显缺点,限制了其在临床上的广泛应用。BALF虽最能反应下呼吸道气道炎症的变化,但由于是一种侵入性检查,患者接受性很差,尤其对于轻症、反复发作的疾病(如哮喘)患者,很难反复进行上述检查。诱导痰技术虽为无创性检查,但雾化吸入高渗盐水本身为一种炎性刺激物,对支气管有激发作用,即使提前使用B2-受体激动剂,患者在激发过程仍可能出现呼吸道原有疾病的加重。此外,诱导痰技术在儿童及重症哮喘患者中禁用。1 呼出气冷凝液(EBC)的采集原理及其成分EBC检查为近年来新出现的呼吸道疾病炎症状态检测方法。EBC中包含着气道内衬液体及其可挥发的成分,是肺内生化、炎症实时状态的无创性标记物。平静呼吸时这些生化分子可随呼出气呼出体外,在外界温度降低时可随水蒸气的凝结而进入EBC。呼吸道疾病患者EBC某些成分有显著异常,这些异常反映了哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、职业性肺疾病时肺内、气道内出现的氧化应激状态和酸碱状态的变化、炎症状态及程度的不同。因此检测呼出气冷凝液中的细胞因子能反应气道炎症情况[1]。由于分段采集EBC的实验尚未成功,各种生化分子产生部位及各部位产生的生化分子在EBC中的具体比例还很难确定。通常EBC中生化分子来源于口腔、咽腔、气管支气管以及肺泡,但其主要成分来源于下呼吸道,故反映了下呼吸道的生化状态。然而,有时气道的某一部位可以很高的速率产生某种物质,如鼻腔可以产生很高浓度的一氧化氮(NO),而体内的一些半衰期长的细胞因子,也可由血液循环带至肺内,并弥散到EBC中。而只有那些非液态分子,及几乎不能或很少穿透肺泡膜(如蛋白)以及那些在血浆中半衰期很短的物质(如过氧化氢、H2O2)才最有可能直接源于气道,也只有这些物质才最能反映气道的生化状态[1]。总之,EBC中主要有以下3种物质:¹正常体温时可挥发的物质,如水、H2O2以及挥发性的有机物等。EBC中可以很容易的检测到这些物质。º难于挥发又不溶于水的物质,由于它们在水以及水性的肺泡内层面构成一双相的界面,由此这一物质相对的在液体中的压力增高,可以随水的蒸发而进入EBC。这些物质包括白三烯B4(LT-B4)和前列腺素等。»无挥发性又易溶于水的物质,如蛋白,则很难由气态进入EBC。但也有理论认为这些物质可在呼气时形成很小的气态物质而进入EBC并检测出来。目前认为分子质量<65ku的蛋白可进入EBC,这些物质包括白介素及干扰素等[1]。由于上述物质在平静呼吸时就出现在呼出气中,当外界温度降低,随着水蒸汽的凝结也就进入EBC。因此,EBC收集原理很简单,只要平静呼吸,将气体呼入一低温的环境中凝结就可形成EBC。正常人呼出气中含有饱和的水蒸汽,温度为37e。#243#国外医学呼吸系统分册 2004年 第24卷 第4期 SectRespirSysForeignMedSci,Aug2004,Vol.24.No.4当外界温度下降时,呼出气中水蒸汽浓度随温度下降而呈指数下降。外界温度为0e和-10e时分别有89.1%和93.7%的水凝结。温度进一步下降,虽可收集更多的EBC,但设备成本增高,而且如使用干冰或液氮作为降温剂,还可能因为温度过低导致水凝结为冰阻塞管道,这对于使用机械通气的患者尤为危险,这可能导致严重后果如动态过度通气等。2 EBC的采集方法目前用于收集EBC方法很多。最简单的EBC收集器就是将以特氟纶为内衬的管子浸入冰浴中,在其一端呼气,另一端收集。现已有专用于EBC收集的设备(如EcoScreen,ErichJAEGERCompany),患者将呼出气直接呼入取样管中,在取样管中,呼出气被冷却到-10e,其中各种非气态成分将凝结于取样管内壁。为防止反复吸入呼出气,该设备还设置一单向阀门将吸入气和呼出气分离。收集EBC时,患者应戴鼻夹,以口器与收集管道连接,平静呼吸,并将气体完全呼入收集管道中。对于重症患者,收集管道可直接与呼吸机的出气管连接。一般情况下成人需要5~10分钟,儿童需要15~20分钟可以收集到1~3ml的EBC。每个人收集的EBC量有差别,这主要取决于其每分通气量,也与吸入气的湿度相关。目前已证实H2O2在EBC中的含量与呼气流速呈正相关,而对于其他物质,尚无一致的看法[2]。因此,患者应保持平静呼吸,以保证EBC检测结果的可重复性。由于鼻腔、鼻窦可产生大量NO及其它化学分子。因此,患者都要求戴鼻夹以排除其干扰。同时,由于唾液中含有高浓度的亚硝酸盐和H2O2,因此收集EBC前患者都要求漱口,同时收集EBC时,如有唾液过多存于口腔或患者咳嗽时应暂停收集。目前的收集EBC的设备都考虑到唾液的影响,可以在口器下方安置储水器以收集唾液,避免污染EBC。市售的设备如EcoScreen也安装了上述储水器,且通过检测EBC中淀粉酶含量确认EBC中不存在唾液污染。目前已在EBC中检测到数千种物质,而且新的物质还不断被发现。多数物质在EBC中含量很低,其临床意义尚未明确,仅有少数几种物质由于其含量较高,而且在不同疾病中浓度不同,且与疾病严重程度相关,因而得到较为深入的研究[1]。3 气道疾病时EBC的测定和意义3.1 哮喘3.1.1 H2O2 EBC检测已在哮喘患者中广泛应用。EBC中已发现多种炎性物质,哮喘患者和正常人的EBC有显著差异,且与哮喘的严重程度相关,可作为评价疾病严重程度的生化标记物,其中对H2O2了解最为深入[1]。H2O2及反应性硫代巴比土酸(TBAR)(一种脂质过氧化/氧化损害的标记物)在哮喘患者中较正常人有显著增高,而H2O2和TBAR增高的比例一致。而且哮喘患者中,H2O2增高与FEV1的下降呈正相关[3]。吸入皮质激素治疗的哮喘患者其EBC中H2O2水平较安慰剂组患者有明显下降,同时,患者在皮质激素治疗后的29日后,其H2O2水平与其FEV1呈负相关。此外,在停止治疗后2周,患者H2O2的水平仍保持稳定[4]。类似的结果也在儿童哮喘患者中被证实。哮喘患儿EBC中H2O2的水平显著高于对照组,且与其临床症状相一致,而且经过抗炎治疗后均有下降。由此可见,EBC中的H2O2水平可以作为监测成人和儿童哮喘患者气道炎症的一种简单而有效的方法,用于评价抗炎药物的治疗效果时特别有益处[5]。3.1.2 硝酸盐/亚硝酸盐类 其它的衍生于氧化剂和过氧化物酶的产物近来也引起了重视。其中,NO代谢产物如硝化酪氨酸(nitrotyrosine)、硝酸盐/亚硝酸盐(nitrate/nitrite)、亚硝基脲(nitrosothiols)等均可在EBC中检测出。硝化酪氨酸(nitrotyrosine)是一种稳定的氧化和过(氧化)亚硝酸盐(peroxynitrite),可以反映体内氧化和过氧化的程度,以此反映体内炎症水平[1]。Hanazawa等比较了EBC中硝基酪氨酸在哮喘患者和非吸烟的正常对照之间水平,其中哮喘患者分为轻度哮喘(未使用激素治疗),中度哮喘患者(吸入激素治疗)以及重度哮喘患者(口服激素)。在未使用激素治疗的轻度哮喘患者中,EBC中硝基酪氨酸水平比正常人有显著增高,而在经过激素治疗后的中、重度哮喘患者则没有升高。而在合并激素治疗的中、重度哮喘患者中,半胱氨酰白三烯(cysteiny-lleukotrienes,Cys-LTs)仍有显著增高,并不因激素治疗而下降[6]。硝酸盐/亚硝酸盐(nitrate/nitrite)都是NO代谢的稳定的终末产物,EBC中硝酸盐/亚硝酸盐的含量可以间接反映呼出气中NO的水平。Corradi等的研究发现哮喘患者其EBC中硝酸盐水平为正常对照的9倍[7];Hanazawa等研究发现,哮喘患者EBC中亚硝酸盐的水平是正常对照的3倍。Ganas等发现在哮喘患者中,EBC中总硝酸盐/亚硝酸盐水平显著增高,而且与H2O2水平正相关[8,9]。由于EBC硝酸盐/亚硝酸盐的检测方法简单、可靠,已广泛用于气道炎症水平的监测。近年来,已开始使用亚硝基脲(nitrosothiols)对哮喘患者的抗氧#244#国外医学呼吸系统分册 2004年 第24卷 第4期 SectRespirSysForeignMedSci,Aug2004,Vol.24.No.4化反应进行研究,亚硝基脲是NO与抗氧化剂(如谷光甘肽)作用的产物,轻症哮喘患者中亚硝基脲无明确改变,而严重哮喘患者中其水平有显著升高,这也提示可以通过亚硝基脲的水平来对哮喘严重程度进行分类[10]。3.1.3 前列腺素衍生物 近年来,前列腺素衍生物(isoprostanes),作为哮喘患者气道炎症的生化指标也开始被深入的研究。Isoprostanes是由自由基催化的花生四烯酸产物,其化学性质稳定,可反映体内的氧化应激和脂质过氧化水平。而其中的8-isoprostane(属于F2isoprostane家族),是当今研究最多的isoprostanes。研究发现,所有哮喘患者,EBC中8-isoprostane均比正常人有显著增高,而且其增高的程度与疾病的严重程度相关,但目前尚未发现8-isoprostane水平与肺功能相关[11-13]。3.1.4 白三烯(LTs) LTs是花生四烯酸经5-脂氧酶(5-LO)代谢途径形成的代谢产物,包括二羟酸白三烯(LTB4)及半胱氨酰白三烯(cysteiny-lleukotrienes,Cys-LTs,包括LTC4、LTD4、LTE4),它们在很多呼吸系统疾病中都起到了很重要的作用。其中Cys-LTs可引起支气管平滑肌收缩,增加血管通透性,促进黏液分泌,在哮喘发病的很多环节都起到了重要作用。而LTB4则可以为中性粒细胞的趋化因子,能促进中性粒细胞在气道的聚集,因而在重症哮喘以及COPD的发生发展中起到重要作用。在哮喘患者EBC中,Cys-LTs的水平显著增高,而且随哮喘病情的加重而增加。但是,在中重度哮喘患者中,Cys-LTs水平与FEV1并无相关性[12,14]。在重症哮喘患者(PEF<60%Pred),LTB4水平为轻度哮喘(PEF>80%Pred)患者的9倍。但是,也未发现LTB4水平与肺功能相关。同时,哮喘患者其EBC白三烯水平显著升高,且激素治疗前后无明显变化,这说明激素治疗并不能抑制白三烯对哮喘发病的作用,而应针对白三烯代谢过程或受体进行针对性治疗[14]。3.1.5 白介素及干扰素 Shahid等检测儿童哮喘患者EBC中IL-4和IFN-C的水平,在哮喘患儿中,无论是否使用激素治疗,其EBC中IFN-C水平都显著降低,而IL-4水平在未用激素治疗的患儿中明显增高,经激素治疗后的患儿中无明显变化,因此,IL-4/IFN-C比值在未用激素治疗的患儿中有显著升高。由此可见,通过EBC检测,也可发现哮喘患者中气道内存在的TH2细胞优势[15]。3.1.6 pH水平 正常人EBC中pH水平与痰液和BALF中水平相似,而在哮喘急性发作的患者中,pH有明显下降,经激素治疗后,pH水平又恢复正常,哮喘患者pH水平下降也与呼出气中NO浓度的增加呈正相关。这提示通过监测EBC中pH的变化,也许有助于明确抗炎治疗的效果。但由于目前在pH检测过程中,很难彻底去除EBC中CO2,难以避免其对结果的干扰,结果的可重复性较差[16]。虽然目前仍缺乏长期、前瞻性研究结果的支持,总体上看,检测EBC中生化标记物以监测哮喘具有很好的前景。而且,EBC中生化标记物的不同水平可以作为哮喘严重程度分级的客观指标,特别当这些指标的变化先于其他生理指标时,EBC检测的意义则更为明显。3.2 COPD COPD是一以气道不完全可逆性气流受限为特征的疾病,为累及气道、肺实质以及肺血管的慢性炎症。巨噬细胞、T细胞(主要CD8+细胞)和中性粒细胞在肺的不同部位浸润增加。活化的炎症细胞释放各种炎性介质,包括LTB4、IL-8、TNF-A以及其它可引起肺组织损伤和(或)维持中性粒细胞性炎症的细胞因子。除了炎症以外,肺组织氧化应激以及抗氧化物之间失衡对COPD的发生、发展也起到主要作用。COPD患者的EBC中H2O2比正常人有显著增高,而且在COPD急性加重期时比稳定期时又有显著增加。EBC中H2O2水平还与诱导痰中嗜酸粒细胞值正相关,但是,不论急性加重期还是稳定期,均未发现H2O2水平与FEV1水平存在相关性。Montuschi等发现,无论是未吸烟的COPD患者还是吸烟患者,EBC中8-isoprostane水平相似,均较正常吸烟者有显著增高。而且,吸烟后15分钟,EBC中8-isoprostane即增高50%,这也反映了吸烟引起下气道氧化应激状态。同时,已证实EBC中亚硝酸盐以及亚硝基脲水平在COPD患者中,比正常人以及正常吸烟者有显著增高[17]。上述发现均证实在COPD患者中,不论急性加重期还是稳定期,都有气道炎症存在。而且在急性加重期和吸烟后,氧化应激水平均有明显增高。因此,监测EBC中的生化指标有助于发现COPD的病情变化,是病理生理指标的积极补充。3.3 吸烟者 H2O2,作为氧化代谢的产物,可以反应组织中氧化的活性。在吸烟者中,EBC中H2O2的浓度为非吸烟者的5倍,同时,男性吸烟者中水平高于女性吸烟者[1]。3.4 ALI/ARDS ARDS患者与其他呼吸道疾病包括肺炎患者相比,其EBC中H2O2水平有显著增高,也比正常对照有显著增高。其中,由败血症以及#245#国外医学呼吸系统分册 2004年 第24卷 第4期 SectRespirSysForeignMedSci,Aug2004,Vol.24.No.4