第 1 页 共 5 页 植物原生质体培养方法
原生质体培养办法主要有固体培养法、液体培养法和固一液结合培养法。另外对于低细胞密度的原生质体培养，还可以采纳饲养层培养法、共培养法和微滴培养法等。而在原生质体应用于生物转化中时，常常采纳固定化原生质体培养技术举行固定培养。一、固体平板培养法原生质体的培养办法和对培养条件的要求常与单细胞培养相像。故原生质体的培养也可根据单细胞的平板办法举行。首先把原生质体悬浮在液体培养基中(密度为104个／mL左右)，与高压灭菌后冷却至42～45℃的培养基(2倍固化剂浓度)用大口刻度吸管快速等量混匀，并快速转移到培养皿中，旋转培养皿，眨眼便凝固，用石蜡膜带密封，暗培养。培养基层不宜过厚，普通2～3mm。培养5～7d原生质体开头分裂，3周左右观看细胞植板率。待形成大细胞团后，转移到去除渗透压调整剂的新奇固体培养基中继代培养。近年来发觉，用琼脂糖代替琼脂粉可以提高植板率。特殊是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体，用法琼脂糖可能会取得比较好的效果。低熔点琼脂糖可在30℃左右溶化，与原生质体混合不影响原生质体的活力。该办法的优点：原生质体分布匀称，有利于分裂；简单获得单细胞株系；可定位观看单个原生质体的生长发育状况。缺点：原生质体易受热损害；易破裂；原生质体始终处在高渗透压胁迫下，生长发育缓慢，植板率低。二、液体浅层培养法尽管固体培养有上述优点，但无数讨论者还是喜爱 用法液体培养基，这是由于，当用法液体培养基的时候，经过几天培养之后，可用有效的办法把培养基中的渗透压降低；另外，假如原生质体群体中的蜕变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以随时更换培养基；再有，经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或把目标细胞分别出来。本办法是用液体培养基举行原生质体培养。把纯化后的原生质体用液体培养基调节好密度，用吸管转移到培养皿中，石蜡膜带密封，在培养室暗培养。培养基层厚2～3mm。培养5～10d细胞开头分裂，此时开头降低培养基中的渗透压。每隔一周用刻度吸管吸取不
药用植物组织培养
一、名词解释：
1、初代培养:从植物体上分离下来的第一次培养叫初代培养，或叫第一代培养。
2、继代培养：以后将培养物转移到新的培养基上进行培养称为继代培养，也可细分为第二代培养，第三代培养。
3、药用植物组织培养: 是以现代生命科学理论为基础，结合化学学科的科学原理，采用先进的生物工程技术手段，以药用植物为研究对象，进行其组织器官的发生、培养和细胞融合、转化以及次生代谢产物和药材组培苗工厂化生产研究的一门新兴的综合性应用学科。
4、外植体：是指由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织和器官。
5、培养基：根据植物营养原理和植物组织离体培养要求而人工配制的营养基质。它通常含有无机元素、维生素、氨基酸、糖类、植物生长调节物质、固化物、活性炭、天然提取的营养物、水组成。是植物组织生长的物质基础，也是植物组织培养能否成功的重要因素之一。
6、愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体上长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
7、胚状体：指的是在植物组织培养中起源于一个非合子细胞（合子细胞：两性配子相融合形成的新细胞），经过胚胎发生和胚胎发育的过程形成双极性的胚状结构。
8、细胞分化:是细胞功能特化的过程
9、细胞脱分化：是指一个成熟细胞回复到分生状态或胚性细胞状态的现象。即失去已分化细胞的典型特征。
10、细胞再分化：是脱分化的分生细胞重新恢复细胞分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞。
11、外植体：是指用于无菌培养的离体植物材料。即泛指第一次接种所用的植物组织、器官等一切材料。 选择合适的植物材料是进行组织培养关键的一步。
12、愈伤组织的继代培养： 愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，次生代谢产物的积累，原有的培养基已不适宜愈伤组织的生长，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做愈伤组织的继代培养。
第六章：植物原生质体培养
请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。）
自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。“神舟四号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。
此外，太空环境还是一个微重力环境。中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。
自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。
6.1 原生质体的概念和研究进展
原生质体的培养
1. 原生质体的分离与纯化
原生质体培养的意义
(1)再生植株 由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离
（一）材料来源
原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。
