BCA蛋白浓度测定
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按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分 混匀。根据样品数量计算所需BCA工作液体积，每个样品需要200μL的BCA 工作液，再加上标准品所需2mL，例如10个样品，所需体积为0.2 mL×10+2 mL =4 mL，取4 mL BCA试剂A，加入80μL BCA试剂B，混匀，配制成4.8mL BCA 工作液， BCA工作液室温24小时内稳定。 5. 将0.5mg/mL蛋白标准溶液按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的标准品
0.593667
0.3
16
0.736
0.738
0.732
0.735333
0.4
20
0.957
0.966
0.952
0.958333
0.5
用 Excel 或 orgin 作出吸光度对 BSA 浓度的关系曲线。
六、实验结果分析 得到的吸光度对 BSA 浓度的关系曲线 R2 值大于 0.99 的时数据较好。如果
BCA 蛋白浓度测定
一、实验原理：
BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混
合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，
蛋白质将 Cu2+还原为 Cu+，一个 Cu+螯合二个 BCA 分子，工作试剂由原来的苹
果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在 562nm 处显示最大吸光性，吸光度
孔中，加标准品稀释液补足到20μL。 6. 加适量体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释补充到20μL。
注：测量浓度请需要对样品进行稀释，使其的浓度范围在0.5-5 mg/mL 之间，保证样品浓度在线性范围内，一般样品需要稀释5-10倍即可，根据 实际蛋白浓度适当调整。
7. 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置20-30分钟。 注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度
编号吸光度Fra bibliotek吸光度
吸光度
平均吸光度 浓度(mg/mL)
0
0
0
0
0
0
1
0.042
0.046
0.04
0.042667
0.025
2
0.103
0.108
0.101
0.104
0.05
4
0.209
0.211
0.205
0.208333
0.1
8
0.396
0.396
0.393
0.395
0.2
12
0.597
0.599
0.585
注：双向电泳裂解液中有较高含量的 DTT，所以不能使用 BCA 法测定，或者是测完浓 度上样前再加入 DDT。
三、保存条件：
A、B 液室温保存。
蛋白标准配制成溶液后-20℃冻存。 四、操作步骤：
1. 提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪。 2. 配制25mg/mL蛋白标准溶液母液。
取1.2mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶 解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃ 长期保存。 3. 配制0.5mg/mL蛋白标准溶液
R2 值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点： 一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液 体体积不准确。
注意事项： 建议每次测定时都做标准曲线。因为 BCA 法测定时颜色会随着时间的延长 不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间 和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA， 二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。这些不适用BCA法的样品， 可以使用Bradford蛋白浓度测定法。
取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL。取20μL 25mg/mL蛋白标准，加入980μL稀释液即可配制成0.5mg/mL蛋白标准，并 分装到200μL的离心管中，每管80μL，-20℃长期保存，需要使用取出一管 溶解后使用。 注：蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便 起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。 4. 配制BCA工作液
和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓
度。
二、试剂盒说明： 1. 检测浓度下限达到10μg/mL，最小检测蛋白量达到0.2μg，待测样
品体积为1-20μL。在20-1000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。 2. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可
时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
8. 使用紫外分光光度计或酶标仪测定A562吸光度，540-595nm之间的波长也 可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
五、实验数据及处理
测得三次重复实验 BSA 溶液的吸光度如下：
0.593667
0.3
16
0.736
0.738
0.732
0.735333
0.4
20
0.957
0.966
0.952
0.958333
0.5
用 Excel 或 orgin 作出吸光度对 BSA 浓度的关系曲线。
六、实验结果分析 得到的吸光度对 BSA 浓度的关系曲线 R2 值大于 0.99 的时数据较好。如果
BCA 蛋白浓度测定
一、实验原理：
BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混
合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，
蛋白质将 Cu2+还原为 Cu+，一个 Cu+螯合二个 BCA 分子，工作试剂由原来的苹
果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在 562nm 处显示最大吸光性，吸光度
孔中，加标准品稀释液补足到20μL。 6. 加适量体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释补充到20μL。
注：测量浓度请需要对样品进行稀释，使其的浓度范围在0.5-5 mg/mL 之间，保证样品浓度在线性范围内，一般样品需要稀释5-10倍即可，根据 实际蛋白浓度适当调整。
7. 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置20-30分钟。 注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度
编号吸光度Fra bibliotek吸光度
吸光度
平均吸光度 浓度(mg/mL)
0
0
0
0
0
0
1
0.042
0.046
0.04
0.042667
0.025
2
0.103
0.108
0.101
0.104
0.05
4
0.209
0.211
0.205
0.208333
0.1
8
0.396
0.396
0.393
0.395
0.2
12
0.597
0.599
0.585
注：双向电泳裂解液中有较高含量的 DTT，所以不能使用 BCA 法测定，或者是测完浓 度上样前再加入 DDT。
三、保存条件：
A、B 液室温保存。
蛋白标准配制成溶液后-20℃冻存。 四、操作步骤：
1. 提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪。 2. 配制25mg/mL蛋白标准溶液母液。
取1.2mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶 解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃ 长期保存。 3. 配制0.5mg/mL蛋白标准溶液
R2 值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点： 一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液 体体积不准确。
注意事项： 建议每次测定时都做标准曲线。因为 BCA 法测定时颜色会随着时间的延长 不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间 和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA， 二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。这些不适用BCA法的样品， 可以使用Bradford蛋白浓度测定法。
取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL。取20μL 25mg/mL蛋白标准，加入980μL稀释液即可配制成0.5mg/mL蛋白标准，并 分装到200μL的离心管中，每管80μL，-20℃长期保存，需要使用取出一管 溶解后使用。 注：蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便 起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。 4. 配制BCA工作液
和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓
度。
二、试剂盒说明： 1. 检测浓度下限达到10μg/mL，最小检测蛋白量达到0.2μg，待测样
品体积为1-20μL。在20-1000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。 2. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可
时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
8. 使用紫外分光光度计或酶标仪测定A562吸光度，540-595nm之间的波长也 可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
五、实验数据及处理
测得三次重复实验 BSA 溶液的吸光度如下：
