蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定
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当前乳制品行业中蛋白质含量的测定方法
乳制品行业中蛋白质含量的测定方法一直是一个备受关注的话题。
随着乳制品的消费量不断增加，人们对产品质量和安全的关注度也越来越高。
了解和掌握乳制品中蛋白质含量的测定方法是至关重要的。
蛋白质是乳制品中的重要营养成分，对于产品的质量和营养价值具有决定性的影响。
精确测定乳制品中蛋白质含量对于生产商来说至关重要。
目前，常用的乳制品中蛋白质含量测定方法主要包括以下几种：一、凝固法这种方法在测定乳制品中蛋白质含量时被广泛采用。
其基本原理是通过添加酸或酶来使蛋白质凝固，然后用物理或化学方法将其分离，并通过测量其含量来计算蛋白质含量。
这种方法简单易行，且准确性高，因此在实际生产中得到了较广泛的应用。
二、测氮法测氮法是通过测量乳制品中的总氮含量来计算蛋白质含量的方法。
根据蛋白质中氮含量较高的特点，通过测量总氮含量并进行相关计算，可以得到蛋白质含量。
这种方法准确性较高，但需要较为专业的仪器设备和技术支持。
三、光学法光学法是通过测量乳制品中蛋白质的光学特性来计算其含量的方法。
通过特定的光学仪器，可以测量乳制品中蛋白质的吸收、散射等光学性质，从而计算出其含量。
这种方法操作简便，但对仪器设备和环境要求较高。
四、免疫学方法免疫学方法是通过免疫学反应来测定乳制品中蛋白质含量的方法。
通过识别蛋白质特定的抗原和抗体反应，可以测定蛋白质的含量。
这种方法的优点是高灵敏度、高特异性，但同时也需要较为专业的实验条件和技术支持。
以上几种方法各有优劣，可以根据实际需求和条件选择合适的方法来进行蛋白质含量的测定。
为了确保测定结果的准确性和可靠性，在进行测定时需要严格按照相关标准和规定来操作，并做好实验记录和数据分析工作。
乳制品行业中蛋白质含量的测定方法是一个复杂而又重要的课题。
只有掌握了准确的测定方法，才能确保产品质量和安全，满足消费者的需求。
生产商和相关研究人员需要在实践中不断探索和创新，提高对蛋白质含量测定方法的理解和应用水平，为乳制品行业的发展做出积极贡献。
乳粉中蛋白质含量的测定(精)
3、碱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ蒸馏
量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂2～3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。将10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。
《食品营养与检测》综合技能实训指导书
实训项目名称
乳粉中蛋白质含量的测定
学时
4学时
实训目的
1.通过本实验掌握乳粉中蛋白质含量的测定方法
2.通过实验了解乳粉中蛋白质含量测定的原理及操作要点
一、实验原理
蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
2、定氮装置的检查与洗涤
检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
测定前定氮装置如下法洗涤2～3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。
量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂2～3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。将10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。
《食品营养与检测》综合技能实训指导书
实训项目名称
乳粉中蛋白质含量的测定
学时
4学时
实训目的
1.通过本实验掌握乳粉中蛋白质含量的测定方法
2.通过实验了解乳粉中蛋白质含量测定的原理及操作要点
一、实验原理
蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
2、定氮装置的检查与洗涤
检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
测定前定氮装置如下法洗涤2～3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。
乳及乳制品中蛋白质含量的测定
２ ０ １ ４年 ・ 第７ 期（ 总４ ３ ２ 期）
表 ４ 方差分析
表 ５ 不同处理 经济效益分析
产量
处 理
产值
投入化肥成本
收入
产 投 比 ｋ ｇ ／ｈ ｍ ／ （ 元 ／ｈ ｍ ２ ） ／ （ 元 ／ｈ ｍ ） ／ （ 元 ／ｈ ｍ ）
处理 １ １ ０ ２ ６ ６ ． ４ ５ ３ ７ ９ ８ ５ ． ５ ５
添加 其 回收率都在 ９ ９ ． ５ ％ １ ０ ０ ． ５ ％之 间 ， 说 明两种测 定方法
无明显异常 ， 数据稳定可靠 ， 并且用 Ｆ Ｏ Ｓ Ｓ －８ ４ ０ ０型全 自动凯
表 １ 不 同样品对比实验结果
表２ Ｆ ＯＳ Ｓ 一 ８ ４ ０ ０全 自动凯氏定氮仪
（ 下转第 ２ ８ 页）
在两 种方法 精确 度实验 中 ， Ｆ Ｏ Ｓ Ｓ －８ ４ ０ ０型全 自动定氮 仪对几种乳制 品测定值 的相对标 准偏差低于 ０ ． ５ ８ ％； 准确度 实验 中 ， 回收率在 ９ ９ ． ７ ９ ％ ～１ ０ ０ ． １ １ ％之 间 ， 说明 Ｆ Ｏ Ｓ Ｓ －８ ４ ０ ０
【 ２ １ 于守洋， 刘志诚 营养与食品卫 生监督检验方 法指 南 １ ９ ８ ９ ［ Ｍ１ ． 北京 ：
用的化肥零售价计 算。
临泽县玉米生产的有效施 肥技术大面积推广应用 。
（ 责任编辑
田 野）
（ ｋ 接第 ２ ５页） 表 ３ 半微量 凯式定氮蒸馏
氏定氮仪测定乳及乳制 品中蛋 白质含量准确度较高 。
３ 结 论
参考文献
［ １ ］ 刘志皋 食品营养学【 Ｍ】 北京： 中国轻 工业出版社， １ ９ ９ １ ， ９ ８ — １ ４ ４ ．
SDS-PAGE法对乳及乳制品中主要蛋白的定性和定量分析
I FOOD INDUSTRY I 97FOOD INDUSTRY I THEORYSDS-PAGE法对乳及乳制品中主要蛋白的定性和定量分析文 刘利娟鹤壁职业技术学院肪层，留取清液备用，清液、水、样品缓冲液以1:1:2的混合，沸水浴加热10min ，10000r/min 离心10min ，取清液分装，备用。
称取1g 婴幼儿配方奶粉样品，用双蒸水定容至10mL ，10000r/min ，转速下离心15min ，步骤同鲜牛乳样品。
1.3.2 电泳条件配制15%分离胶：30%丙烯酰单体胺储备6mL,分离胶缓冲液3mL ，10%SDS 120μL ，双蒸水3mL ，10%过硫酸铵60μL ，TEMED 6μL 。
配制4%浓缩胶：30%丙烯酰单体胺储备0.67mL ，浓缩胶缓冲液1mL ，10%SDS 40μL ，双蒸水3.33mL ，10%过硫酸铵30μL ，TEMED 10μL 。
将制备好的胶放入电泳槽内，加入电极缓冲液，将梳子垂直缓慢地拔出，分别对样品和标准品进行不同浓度、不同体积进样。
预电泳电压80V ，分离胶与浓缩胶分界处改为130V 电压完成电泳。
0.1%考马斯亮蓝溶液染色1h ，脱色液洗脱过夜，至凝胶背景为透明无色。
2. 结果与分析2.1 分离胶浓度的选择SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。
本实验采用不连续系统的优点在于样品可以在进入分离胶之前在浓缩胶上达到相同的速度，即使样品达到相同的初速度和初始值。
带电胶粒在电场作用下向着与自身相反的电荷方向移动，且分子量越小的粒子，受到的阻力越小，分子迁移的速度越快，分子量越大的粒子收到的阻力越大，迁移速度婴幼儿配方奶粉是以母乳为标准，选自优质乳牛的奶源，对牛奶的主要蛋白质成分调整，使其最大限度地接近母乳，从而更适合婴儿的肠胃吸收和营养需求。
牛乳中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两个重要组成部分，其中酪蛋白占乳总蛋白含量约80%，酪蛋白主要包含αs 1-酪蛋白、αs 2-酪蛋白、β-酪蛋白和Ƙ-酪蛋白四种蛋白质，分别占总酪蛋白的比例为4:1:4:1，乳清蛋白占乳总蛋白含量约20%，乳清蛋白主要由α-乳白蛋白（Q-LA ）、β-乳球蛋白（B-LG ）、免疫球蛋白（Ig ）和牛血清蛋白（BSA ）组成，分别占总乳清蛋白的5:2:8:5。
乳制品的检测项目及检验方法标准
乳制品的检测项目及检验方法标准范本1：一、乳制品的检测项目及检验方法标准乳制品是人们日常饮食中常见的食品之一，其质量安全对人们的健康至关重要。
为了确保乳制品的质量和安全，需要进行一系列的检测项目，并依照相应的检验方法标准进行检验。
以下是乳制品的检测项目及检验方法标准的详细内容：1. 外观检测1.1 外观检查：检查乳制品的颜色、形状、质地等外观特征是否符合要求。
1.2 味道检查：通过嗅觉判断乳制品是否有异常气味，如酸味、异味等。
2. 脂肪含量检测2.1 脂肪含量测定：采用脂肪酸碽测法、蓝色试剂法等方法测定乳制品中的脂肪含量。
3. 蛋白质含量检测3.1 Kjeldahl氮测定法：通过测定乳制品中的氮含量，计算出蛋白质含量。
4.1 还原糖含量测定：采用费林氏方法、硼酸铂试剂法等方法测定乳制品中的还原糖含量。
5. 抗生素残留检测5.1 溶菌酶酶促法：采用溶菌酶酶促法检测乳制品中的抗生素残留。
附件：本文档涉及的附件包括：外观检测表、脂肪含量检测表、蛋白质含量检测表、糖含量检测表、抗生素残留检测表等。
法律名词及注释：1.检测项目：指乳制品检测中需要进行的具体检测内容。
2.检验方法标准：指乳制品检验中对于不同检测项目所制定的具体检验方法和标准。
范本2：一、乳制品的检测项目及检验方法标准乳制品的质量和安全是人们关注的重点。
为了确保乳制品的质量可靠，需要进行一系列的检测项目，并依照相应的检验方法标准进行检验。
下面是乳制品的检测项目及检验方法标准的详细介绍：1.1 外观检查：检查乳制品的颜色、形状、质地等外观特征是否符合要求。
1.2 味道检查：通过嗅觉判断乳制品是否有异常气味，如酸味、异味等。
2. 脂肪含量检测2.1 脂肪含量测定：采用脂肪酸碽测法、蓝色试剂法等方法测定乳制品中的脂肪含量。
3. 蛋白质含量检测3.1 Kjeldahl氮测定法：通过测定乳制品中的氮含量，计算出蛋白质含量。
4. 糖含量检测4.1 还原糖含量测定：采用费林氏方法、硼酸铂试剂法等方法测定乳制品中的还原糖含量。
乳与乳制品中的蛋白质含量快速检测方法
乳与乳制品中的蛋白质含量快速检测方法摘要】目的建立一种快速测定乳与乳制品中蛋白质含量的办法。
方法用双缩脲反应测定蛋白质含量。
结果工作曲线在（０—0.20）g/100ml蛋白质浓度范围内遵守朗伯比尔定律，线性关系良好。
曲线的回归方程为：Y＝0.004868+3.018Ｘ，相关系数r=0.9993，加标回收率（95.00－104.00）%。
方法的检出限0.02g/100ml。
结论该方法操作简便、快捷、准确，灵敏度和精密度高，适用于乳与乳制品中蛋白质含量的快速测定。
【关键词】乳与乳制品；双缩脲－分光光度法；蛋白质测定。
【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-9753（2018）09-0283-01乳与乳制品是人体所需蛋白质的重要来源，近年来因乳与乳制品频频出现问题，蛋白质含量测定的国标方法是将样品消化后测定总氮量，再由总氮量计算蛋白质的含量，测定的结果不完全是蛋白质，还包括一些非蛋白质类的含氮物质；并且这些检测方法检测时间长，用酸量大，能源消耗大，不适合批量样品测定。
本文基于蛋白质的分子结构，拟定出双缩脲分光光度法快速测定乳与乳制品中蛋白质含量的新方法，并探讨了样品的预处理方法。
１、材料与方法１.１原理双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜结合生成红紫色的络合物。
具有两个以上肽链的化合物与双缩脲结构相似，也有此反应。
其色泽深度与蛋白质含量成正比，可以比色定量[1]。
１.2试剂与仪器１.2.1仪器７２２分光光度计，ＦＡ2104型1/万电子天平。
1.2.2试剂[2](１）双缩脲试剂称取①硫酸铜（CuSO4H2O）3.0g；②酒石酸钾钠（NaKCH4O 64H2O）9.0g;③碘化钾（KI）5.0g，各溶于25ml水中,将②③倾入1000ml容量瓶中，加入100ml240g/L的NaOH溶液，混匀。
加①液最后加水至1000ml。
(2)氨水、乙醇、乙醚、石油醚（沸程300C－600C）。
1.2.3 标准品制备[3] 取纯正乳粉（未添加非蛋白质类的含氮物质）适量于1000C±50C干燥2 h，至前后两次相差不超过2mg。
对蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定分析
221对蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定分析毛 筠（江苏省食品药品检验研究院，江苏 南京 ２１００００）摘 要：本文主要分析了蛋白质检测方法以及乳制品种蛋白含量测定的重要性，并对蛋白质检测的方法及测定方法进行了阐述，仅供参考。
关键词：蛋白质；检测方法；乳制品；蛋白含量；测定中图分类号：ＴＱ９３７ 文献标识码：Ａ作者简介：毛筠，江苏省食品药品检验研究院。
人体细胞的重要组成成分就是蛋白质，根据相关的研究可以知道，人体能量种蛋白质占有18%左右，与人体的生命现象有着直接影响，随着社会经济的不断发展，人们的生活品质不断提高，因此对乳制品的要求也越来越高，而目前乳制品的蛋白质质量相对较差，在很大程度上对乳制品的生产质量造成了影响，因此对蛋白质检测方法进行研究十分重要。
1 蛋白质检测方法以及乳制品种蛋白含量检测的重要性研究蛋白质最重要的组成部分就是氨基酸，因为在食品当中氨基酸的种类相对较少，导致食品的营养价值不能得到保证，在食品中其蛋白质主要包括完全蛋白质、不完全蛋白质以及半完全蛋白质等三种，为了能够让食品的安全得到保证，使用科学、合理的检测方法变得尤为重要，在对乳制品中蛋白的含量进行测定时，试验人员必须要对试验测定的温度进行严格控制，如果试验的温度超过了标准温度，就会使蛋白质结构的稳定性降低，而如果温度低于标准温度，则会导致蛋白质的活性降低，最终不能保证试验结果的准确性。
在肉类、奶类以及豆类的食品当中都含有大量的蛋白质，为了让乳制品中的蛋白质品质得到保证，使用科学的测定方法非常重要。
在实际的测定工作当中，乳制品蛋白质含量的测定人员应该与蛋白质的分子结构特点想借个，将原有的测定方法不断改进，进一步将乳制品蛋白质含量测定结果的准确性有效提高，比如在对乳制品蛋白质含量测定的过程中，如果使用的测定方法不合理、不科学，就会导致蛋白质发生严重的变性情况，让蛋白质折叠的自发性降低，最终出现严重的食品安全问题，对人们的生命财产安全构成严重的威胁。
乳及乳制品的质量的测定
乳及乳制品中蛋白质的测定——常量凯式定氮法1原理试样、浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而试样中的有机氮转化为氮，并与硫酸结合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏，使氨逸出，用硼酸溶液吸收出，再以标准盐酸溶液滴定。
根据消耗的标准盐酸溶液滴定。
根据消耗的标准盐酸溶液的体积可计算蛋白质的含量。
根据试样的测试步骤，包括以下几个方面。
1.消化将试样与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而试样中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。
在消化过程，利用浓硫酸的脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。
反应式为NH2CH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3同时浓硫酸又具有氧化性，使炭化候后的碳进一步氧化为二氧化碳，硫酸同时被还原成二氧化硫，反应式为2H2SO4+C→CO2+2SO2+2H2O最后二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中:2NH3+H2SO4→(NH4)2SO42.蒸馏在消化完全的试样消化液中加入碱液（浓氢氧化钠）使之碱化，消化液中的氨被游离出来，通过加热蒸馏释放出氨气，反应方程式如下：（NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH33.吸收与滴定蒸馏所释放出来的氨，用弱酸溶液（如硼酸）进行吸收，与氨形成强碱弱酸盐，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定。
吸收及滴定反应方程式如下：2NH3+4H2BO3→(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O →2NH4Cl+4H3BO3本测定中滴定指示剂是用按一定比例配成的甲基红-溴甲酚绿混合指示剂。
甲基红PH4.2~6.3变色，由红变为黄，终点为橙色，溴甲酚绿在PH3.8~5.4变色，由黄变蓝，终点为绿色。
当两种指示剂按适当比例混合时，在PH5以上呈绿色，在PH5一下为橙红色，在PH5时因互补色关系呈紫灰色，因此滴定终点十分明显，易于掌握。
当前乳制品行业中蛋白质含量的测定方法
当前乳制品行业中蛋白质含量的测定方法当前乳制品行业中蛋白质含量的测定方法引言：乳制品是人们日常饮食中重要的营养来源之一。
蛋白质是乳制品中的重要成分之一，对人体健康发育至关重要。
准确测定乳制品中蛋白质的含量，对生产者和消费者都具有重要意义。
然而，当前乳制品行业中的蛋白质含量测定方法是否准确和全面仍然存在讨论。
本文将从深度和广度两个方面对乳制品行业中蛋白质含量的测定方法进行全面评估，并探讨其可行性和局限性。
一、目前常用的乳制品蛋白质含量测定方法1. 总氮法：总氮法是测定乳制品中蛋白质含量的传统方法之一。
通过测定样品中的总氮含量，再根据乳制品中蛋白质氮的比例将其转化为蛋白质含量。
这种方法简单快捷，被广泛应用于乳制品行业。
然而，总氮法存在一个重要局限性，即不能区分氨基酸和蛋白质的含量，导致过高估计蛋白质含量。
2. Kjeldahl法：Kjeldahl法也是一种常用的测定乳制品中蛋白质含量的方法。
该方法通过将样品中的蛋白质分解为氨基酸，再转化为氨，并通过滴定法测定氨的含量，从而计算出蛋白质含量。
Kjeldahl法的准确性和稳定性得到了广泛认可，但是该方法操作复杂，耗时较长，不适合大规模应用。
3. 高效液相色谱法（HPLC）：高效液相色谱法是一种精确测定乳制品中蛋白质含量的方法。
该方法通过将样品中的蛋白质分离，再通过检测色谱柱流出物中的吸光度，计算出蛋白质的含量。
HPLC法能够准确测定各种氨基酸的含量，并且能够分析出蛋白质的组成和结构。
然而，HPLC方法需要复杂的仪器设备和专业的技术支持，操作难度较大，限制了其在乳制品行业的应用。
二、对乳制品行业中蛋白质测定方法的评估1. 准确性：在测定乳制品中蛋白质含量的过程中，准确性是最重要的指标之一。
从常用的测定方法来看，总氮法和Kjeldahl法相对简便，但不能区分氨基酸和蛋白质，可能导致过高估计蛋白质含量。
而HPLC法能够准确测定各种氨基酸的含量，但操作复杂，需专业技术支持。
考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量
g / 100 mL
酸酸乳 优酸乳
对 6 份乳与乳制品样品进行两种方法测定的配 对 t检验, 统计比较结果见表 3 。 t= 1 628 , P > 0 1, 说明两种方法无明显差异 , 利用考马斯亮蓝法测定 样品的结果准确可靠。
表 3 两种方法测定结果比较 样品号 考马斯亮蓝法 凯氏定氮法
生鲜牛乳 生鲜牛乳 纯牛奶 纯牛奶 1 2 1 2[ 3- 4 ] Nhomakorabea冯
昕 等 : 考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量
3) 。
表 1 不同蛋白质标准溶液的吸光度 蛋白浓度
/ g ( 100 mL )
-1
0 0
0 01
0 04 0 08
0 12 0 16
0 18
吸光 值
0 089 0 157 0 287 0 435 0 586 0 718
2 . 2 线性范围和检出限 工作曲线的蛋白浓度在 0~ 0 18 g / 100 mL 范 围内符合比尔定律, 线性关系良好。然后以试剂空 白值吸光度的 3 倍标准偏差计算检出限, 检出限为 0 02 g /100 mL; 检出限的验证, 添加检出 限浓度空 白样加标 , 回收率达到 92 5 % , 偏差小于 20 % 。 2 . 3 精密度试验 对 6 份乳与乳制品样品进行精密度试验, 按照 1 . 2 . 2 方法测定蛋白质的含量 , 结果表明蛋白质吸 光度的 RSD 为 0 89 % 。 2 . 4 稳定性试验 在同一乳与乳制品样品中加入 4 0 m L 考马斯 亮蓝 G- 250 溶液, 摇匀 , 在 4 h 内, 每隔 1 h 测定 1 次蛋白质含量, 计算其 RSD 值。由试验结果可知 , 同一乳品蛋白质含量的 RSD 为 1 40% , 表明 4 h 内 溶液稳定性良好。 2 . 5 重复性试验 取一定量乳与乳制品样品 6份按 1 . 2 . 2试验方 法进行检测, 计算其蛋白质含量的 RSD 值。结果表 明蛋白质含量的 RSD 值为 0 95 % , 表明其重复性 良好。 2 . 6 加标回收试验 对 2 份生鲜牛乳、 2 份纯牛奶和酸酸乳、 优酸乳 样品分别进行加标回收试验, 每个样品浓度测定 3 次, 结果见表 2 。
酸酸乳 优酸乳
对 6 份乳与乳制品样品进行两种方法测定的配 对 t检验, 统计比较结果见表 3 。 t= 1 628 , P > 0 1, 说明两种方法无明显差异 , 利用考马斯亮蓝法测定 样品的结果准确可靠。
表 3 两种方法测定结果比较 样品号 考马斯亮蓝法 凯氏定氮法
生鲜牛乳 生鲜牛乳 纯牛奶 纯牛奶 1 2 1 2[ 3- 4 ] Nhomakorabea冯
昕 等 : 考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量
3) 。
表 1 不同蛋白质标准溶液的吸光度 蛋白浓度
/ g ( 100 mL )
-1
0 0
0 01
0 04 0 08
0 12 0 16
0 18
吸光 值
0 089 0 157 0 287 0 435 0 586 0 718
2 . 2 线性范围和检出限 工作曲线的蛋白浓度在 0~ 0 18 g / 100 mL 范 围内符合比尔定律, 线性关系良好。然后以试剂空 白值吸光度的 3 倍标准偏差计算检出限, 检出限为 0 02 g /100 mL; 检出限的验证, 添加检出 限浓度空 白样加标 , 回收率达到 92 5 % , 偏差小于 20 % 。 2 . 3 精密度试验 对 6 份乳与乳制品样品进行精密度试验, 按照 1 . 2 . 2 方法测定蛋白质的含量 , 结果表明蛋白质吸 光度的 RSD 为 0 89 % 。 2 . 4 稳定性试验 在同一乳与乳制品样品中加入 4 0 m L 考马斯 亮蓝 G- 250 溶液, 摇匀 , 在 4 h 内, 每隔 1 h 测定 1 次蛋白质含量, 计算其 RSD 值。由试验结果可知 , 同一乳品蛋白质含量的 RSD 为 1 40% , 表明 4 h 内 溶液稳定性良好。 2 . 5 重复性试验 取一定量乳与乳制品样品 6份按 1 . 2 . 2试验方 法进行检测, 计算其蛋白质含量的 RSD 值。结果表 明蛋白质含量的 RSD 值为 0 95 % , 表明其重复性 良好。 2 . 6 加标回收试验 对 2 份生鲜牛乳、 2 份纯牛奶和酸酸乳、 优酸乳 样品分别进行加标回收试验, 每个样品浓度测定 3 次, 结果见表 2 。
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慢速 40~ 60 分钟
紫外吸收法
较为灵敏 50~ 100L g
快速 5~ 10分钟
考马斯亮蓝法 灵敏度最高 ( B rad ford法 ) 1~ 5L g
快速 5~ 15分钟
将蛋 白氮 转化 为氨, 用 非蛋白氮 (可用 三氯 用于标准蛋白质含
酸吸 收后 滴定 测定, 再 乙酸沉淀蛋白质而分 量的 准确 测 定; 干
最近, 由于不法商人向乳制品中添加高含氮量的有机化合物三聚氰胺来冒充蛋白质, 严重 危害了广大消费者的身体健康, 甚至生命安全。引起了公众对乳制品等食品中蛋白质含量测 定问题的关注。本文在此对蛋白质的检测方法和乳制品中蛋白质含量的测定问题进行简单介 绍。
1 蛋白质含量的测定方法
测定蛋白质总含量是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有 4 种经典方法 [ : 124] 凯氏 (K je ldah l)定氮法、双缩脲法 ( B iuret法 )、Folin2酚试剂法 ( Low ry法 )和紫 外吸收法。另外, 还有一种在近几十年才 普遍使用起来的较新的测定法 ) ) ) 考马斯亮蓝法 ( B radford法 ) [ 4 ] 。 1. 1 凯氏 ( K jeldah l)定氮法
凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量, 而是通过测氮含量来推算蛋白质的含量。不法 商人就是利用了这一点, 通过向乳制品中加入高含氮量的有机化合物三聚氰胺来提高其产品 的 / 蛋白 0含量的。在正常情况下, 对于食品, 特别是乳制品中蛋白质含量测定, 这个测定方法 是没有问题的, 因为食品, 特别是乳制品中的主要成分中只有蛋白质含有氮, 其他主要成分脂 肪、碳水化合物都不含氮。因此, 应该说目前食品中蛋白质含量测定的国家标准采用凯氏定氮 法, 通过测定食品中总含氮量来计算蛋白质含量的方法在理论上并没有错。但是, 如果有人往 样品中加入高含氮的其他物质, 如三聚氰胺, 就可以骗过凯氏定氮法获得虚假的蛋白质高含 量。这样, 就可以通过向原奶中兑水, 把水当作牛奶来卖; 向奶粉中添加淀粉等, 将淀粉等当作 奶粉, 甚至婴幼儿配方奶粉来出售。面对这一问题, 仅通过建立食品、特别是乳制品中三聚氰 胺的检测方法是不够的, 因为不法分子为了商业利益可能还会 / 研发 0其他高含氮化合物作为 新的 / 蛋白精 0来替代受到高度关注的三聚氰胺。我们应该面对现实, 修改目前的食品中蛋白 质含量测定的国家标准, 参考或采用早就成为检测牛奶氮含量的国际标准 ( ISO 8968), 在凯氏 定氮法测定样品的总含氮量之后, 再取一份样品, 先用三氯乙酸处理样品, 让蛋白质形成沉淀, 过滤后, 分别测定沉淀和滤液中的氮含量, 就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的物质 的氮含量, 这是生物化学实验教科书中的方法。只有改进国家标准, 堵住漏洞, 才能真正保证 人们吃上放心的食品。
考马斯亮蓝法的突出优点是: ( 1) 灵敏度高, 比 Lowry法约高 4倍, 最低蛋白质检测量可 达 1L g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大, 蛋白质 2染料复合物有更高的消 光系数。 ( 2) 测定快速、简便, 只需加一种试剂。完成一个样品的测定一般只需要 5分钟左 右。由于染料与蛋白质结合的过程大约只要 2分钟即可完成, 其颜色可以在 1小时内保持稳 定, 且在 5分钟至 20分钟之间, 颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry法那样费时和严 格地控制时间。 ( 3) 干扰物质少。如干扰 Lowry法的 K+ 、Na+ 、Mg2+ 、T ris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。
干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差, 专一性差, 干扰物质多, 若样品中含有嘌呤、
嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质, 会出现较大的干扰。虽可以校正, 但还是存在一定的误 差。在用标准曲线法测定蛋白质含量时, 对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大 的蛋白质, 有一定的误差。故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。此外, 由于蛋白质吸收峰常因 pH 的改变而有变化, 因此测定样品时的 pH 要与测定标准曲线的 pH 一致。
费时 较长; 操 作 要 严格 计时; 颜 色 深 浅与蛋白有关
蛋白中的酪氨酸和色氨 各种嘌 呤和 嘧啶; 各 用于 层 析柱 检 测;
酸 残 基 在 280nm 的 光 种核苷酸
核酸吸收可以校正
吸收
考马斯亮蓝染料与蛋白 质 结 合 时, 其 Km ax 由 465nm 变为 595nm
强碱性缓 冲 液; SDS; TritonX2100
将被测试的样品与浓硫酸在硫酸铜和硫酸钾存在下共热消化, 含氮有机物即分解产生氨、 二氧化碳和水, 氨与硫酸反应变成硫酸铵。消化后向消化液中加入强碱碱化使之分解放出氨, 用水蒸气将氨蒸至硼酸液中, 用标准强酸溶液滴定收集氨的硼酸溶液, 即可计算出样品的氮含 量, 从而折算出样品的蛋白质含量 (通常由含氮量乘以系数 6. 25计算出 (该系数为蛋白质平 均含氮量的倒数 ), 乳制品通过乘以系数 6. 38计算出 (该系数为乳制品中蛋白质含氮量的倒 数 ) )。这种方法是 K jeldahl在 1883年发明的, 当时他只使用硫酸分解试样, 测定谷物中的蛋 白含量, 需要较长的反应时间。后来 Gunning搞清楚了消化机理, 在消化时加入 K2 SO4 使反应 温度由原来的 380e (硫酸沸点 )上升到 400e , 并加入硫酸铜为催化剂, 提高了消化速度, 改 进了凯氏定氮法。该方法的缺点是耗时长, 灵敏度低, 样品中的含氮化合物会影响蛋白含量的 测定。要想准确测定出蛋白含量, 可以先测定出总含氮量。再用三氯乙酸将样品溶液中的蛋 白沉淀除去, 然后测定溶液的非蛋白含氮量, 最后从总含氮量中扣除非蛋白含氮量就可以比较 准确地测定出样品的真正蛋白含量。 1. 2 双缩脲法 ( B iu ret法 )
干扰 物质 少; 颜 色 稳定; 颜 色深 浅 与 蛋白质有关
可见, 考马斯亮蓝法和 Folin2酚试剂法灵敏度最高, 比紫外吸收法灵敏 10~ 20倍, 比双缩 脲法灵敏 100倍以上。考马斯亮蓝法由于其突出的优点, 正得到越来越广泛的应用。但表 1 中的后 4种方法并不是通用的, 不能在任何条件下适用于测定任何形式的蛋白质, 因为即使同 一种蛋白质溶液用这 4种方法测定, 也有可能得出 4种不同的结果。即每种测定法都不是完 美无缺的, 都有其优缺点。在选择蛋白质含量的测定方法时应考虑: ( 1) 测定所要求的灵敏度 和精确度; ( 2) 蛋白质的性质; ( 3) 溶液中存在的干扰物质; ( 4) 测定的花费, 包括材料费、仪 器和工时。凯氏定氮法虽然测定过程稍微复杂些, 但通用性强, 测定费用低、仪器简单, 且较准 确, 因此, 常用来测定食品中蛋白质的含量。
2 乳制品中蛋白含量测定
蛋白质的测定方法分为两大类: 一类是利用蛋白质的共性, 即含氮量, 肽链和紫外吸收测 定蛋白质含量, 另一类是利用蛋白质中的特定氨基酸残基以及酸、碱性基团和芳香基团测定蛋 白质含量。由于食品种类很多, 食品中蛋白质含量又各不相同, 特别是其他成分, 如碳水化合
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物, 脂肪和维生素的干扰成分很多。而凯氏定氮法因其通用性强, 测定费用低, 仪器简单, 且比 较准确。因此常用凯氏定氮法来测定食品中的氮含量, 由氮含量计算出蛋白质的含量。
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在 280nm 处具有紫外吸收, 其吸光 度与蛋白质含量成正比。此外, 蛋白质溶液在 238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一
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定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。 紫外吸收法简便、灵敏、快速, 不消耗样品, 测定后能回收。低浓度的盐和大多数缓冲液不
第 24卷 第 1期
大学化学
2009年 2月
蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定
许家喜
(北京 化工大学理学院化工资源有效利用国家重点实验室 北京 100029)
摘要 介绍 5 种常用的蛋 白质检测 方法, 以及凯氏定 氮法在食 品, 特 别是乳制品 蛋白含量 测 定中的应用和存在的问 题, 及其可能的解决方法。
此法的缺点是: ( 1) 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此用于不 同蛋白质测定时有较大的偏差。 ( 2) 主要的干扰物质有: 去污剂、Triton X2100、十二烷基硫酸 钠 ( SDS)和 0. 1mol/L的 N aOH。 ( 3) 标准曲线有轻微的非线性, 因而不能用 Beer定律进行计 算, 而只能用标准曲线来测定。 1. 5 紫外吸收法
表 1 5种常用蛋白质含 量测定方法比较
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
凯氏定氮法 ( K jedah l法 )
灵敏 度 低, 适 用 于 0. 2 ~
1. 0m g 氮, 误 差为 ? 2%
费时 8~ 10小时
双缩脲法 ( B iu ret法 )
灵敏度低 1~ 20m g
中速 20~ 30 分钟
Folin2酚 试 剂 灵敏度高 法 ( Lowry法 ) 约 5L g
双缩脲 ( NH 3CONHCONH 3 )是两分子的脲经 180e 左右加热, 放出 一分子氨后得到的产 物。在强碱性溶液中, 双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物, 称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基
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或两个直接连接的肽键, 或间隔一个碳原子相连的肽键结构的化合物都可以发生双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比, 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关, 可用来测 定蛋白质含量。测定范围为 1~ 10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有: 硫酸铵、Tris缓冲 液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速, 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近, 以及干扰物质 少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速、但并不需要十分精确的蛋白质 测定。
转换成蛋白含量