槲皮素对人乳腺癌裸鼠移植瘤细胞周期的影响
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・基础研究・ 槲皮素对人乳腺癌裸鼠移植瘤
细胞周期的影响吴凯南,马双慰,钟晓刚,孔令泉TheeffectofquercetinonthecellcycleinnudemicewithtransplantationtumorofbreastcarcinomaWUKai2nan,MASHuang2wei,ZHONGXiao2gang,etalDepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospitalofChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016,China
Abstract:Objective Tostudytheeffectofquercetinonthecellcycleinnudemicewithtransplantationtu2morofbreastcarcinoma.Methods 24nudemicewithtransplantationtumorofMCF27wererandomizedinto4groupswithsixmiceineachgroup:controlgroup,quercetingroup,adriamycingroupandcombininggroup.Thecellcycledistributionoftumorwasanalysedbyflowcytometry.TheespressionofcyclinD1wasdetectedbyimmunohistochemistry.Results TherateofphaseG0/G1onthewholecycleofcontrolgroupwassignificantlylowerthanquercetingroup,adriamycingroupandcombininggroup(P<0.01).TherateofphaseSonthewholecycleandtheexpressionofcyclinD1incontrolgroupwerehigherthanthoseofquercetingroup,adri2amycingroupandcombininggrouprespectively(P<0.01).Conclusion QuercetincanactontheG1/Scheckpointoftransplantationtumor,inhibitsthecellproliferationandcyclinD1expressionoftransplantationtumor,retardsthegrowthoftumor.
Keywords:Quercetin;Breastcarcinoma;Cellcycle;CyclinD
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摘 要:目的 研究槲皮素对人乳腺癌细胞株MCF27裸鼠移植瘤细胞周期的影响。方法 24只MCF2
7细胞株移植成功的裸鼠分为对照组、槲皮素组、阿霉素组及联合用药组,每组6只。用流式细胞仪分析细胞周期分布,用免疫组化测定cyclinD1表达水平。结果 G0/G1期占细胞周期比例对照组明显低于槲皮素组,阿霉素组及联合用药组(P<0.01),S期占细胞周期比例对照组明显高于槲皮素组,阿霉素组及联合用药组(P<0.01),cyclinD1表达水平对照组明显高于槲皮素组、阿霉素组及联合用药组(P<0.01)。结论 槲皮素可作用于MCF27移植瘤的G1/S节点,可抑制移植瘤细胞增殖及cyclinD1表达,延缓肿瘤生长。 关键词: 槲皮素;乳腺肿瘤;细胞周期;细胞周期素D
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中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:100028578(2003)0120006203
收稿日期:2002206217;修回日期:2002201207
基金项目:重庆市卫生局医学科研基金资助项目(9922021) 作者单位:400016重庆医科大学附属第一医院普外科
0 引言 槲皮素是一种广泛存在于多种蔬菜水果里的黄酮类化合物,文献报道有广泛的抗肿瘤活性,本实验另一部分已证实槲皮素对人乳腺癌细胞株MCF27裸鼠移植瘤有明确的抑制作用,本文从细胞周期角度探讨其抗肿瘤作用机制。1 材料和方法1.1 实验动物
未交配雌性Balb/c2n/n裸小鼠,鼠龄4～6周,体重10～20g,共26只,购自北京大学医学部动物部(合格证号:医动字0123048),按SPF级动物饲养于
第三军医大学大坪医院野战外科实验动物中心。1.2 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF27购自武汉典型动物保藏中心。1.3 药物及试剂 槲皮素(Quercetin)购自美国sigma公司;阿霉素为浙江海正制药股份有限公司生产;丙二醇(分析纯)为重庆东方试剂厂生产;抗cyclinD1单克隆抗体(鼠抗人,即用型),sp试剂盒(通用型)均购自福州迈新生物技术开发公司。
・6・肿瘤防治研究2003年第30卷第1期1.4 实验方法1.4.1 人乳腺癌细胞株MCF27裸鼠移植瘤的复制 MCF27细胞株培养于含10%小牛血清的RPMI21640培养液中,并按16u/100ml加入精制胰岛素。待传代至足够数量后,取对数生长期细胞用0.25%
胰酶消化成1.0×10
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/ml的细胞悬液,于裸小鼠右侧
第一乳腺部位皮下注射,0.2ml/只。1.4.2 实验分组 接种后28d,26只裸鼠中有24只可见接种部位移植瘤生长,余2只未成瘤。把24只移植瘤接种成功的裸鼠随机分组。A组:对照组,予20%丙二醇,
0.1ml/d,腹腔注射(ip),qd×15d;B组:槲皮素组,予槲皮素50mg/kg.d
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,溶于0.1ml20%丙二醇中,
ip,qd×15d;C组:阿霉素组,予阿霉素5.33mg/kg.d,溶于0.1ml生理盐水,ip,用于第1、8、15天;予20%丙二醇0.1ml/天,ip,qd×15d;D组:联合用药组,予阿霉素5.33mg/kg.d
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,溶于0.1ml生理盐水,
ip,用于第1、8、15天;予槲皮素50mg/kg.d,溶于0.1ml20%丙二醇中,ip,qd×15d。1.4.3 流式细胞仪分析细胞周期 药物处理结束后一天,脱颈椎处死裸鼠,将每个肿块剥出,用剪刀将瘤组织剪碎,并用0.1MPBS液反复冲洗,用200目金属网过滤成单细胞悬液,离心后去掉上清液,再加入0.1MPBS液冲洗,再离心,去掉上清液,加入70%乙醇1ml,边加边振荡。然后上流式细胞仪(FACScanBectonDickinson,美国),作细胞周期采样分析。1.4.4 免疫组化检测cyclinD1的表达
按福州迈新生物技术开发公司提供的S2P法进行免疫组化的检测。结果判断:cyclinD1以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。判断标准:随机选取10个400倍视野,并计数10个视野中的细胞总数及有阳性信号的细胞数,然后得到每张切片的阳性细胞百分率。1.5 统计学处理 采用SAS6.12统计软件包进行统计学分析,实验结果以均数±标准差(x±s)
表示,用方差分析比
较各组细胞周期分布及免疫组化结果。2 结果2.1 用流式细胞仪分析细胞DNA含量分布,各组裸鼠乳腺癌移植瘤细胞周期分布比较,见表1。 S期所占细胞周期分布经方差分析显示,A组高于B、C、D组,提示槲皮素有抑制移植瘤细胞增殖的作用。G0/G1期所占细胞周期分布A组最低,C组次之,均低于B、D组,提示槲皮素可作用于G1/S节点,导致细胞周期停滞于G1期。联合阿霉素用药没有明显增强槲皮素对细胞周期分布的影响。
表1各组裸鼠移植瘤细胞周期分布比较(%)组别nG0/G1SG2/M
A组660.46±2.5421.71±1.7517.83±1.11B组670.48±2.6615.94±1.0913.73±1.96C组665.25±2.5916.46±1.1218.30±1.79D组671.61±2.4915.05±0.6813.39±2.22 方差分析:S期:F=36.36P<0.01, B、C、D组与A组相比,P<0.01, B、C、D组两两之间相比P>0.05, G0/
G1期:F=23.97 P<0.01, B、C、D组与A组相比,P<0.01, C组与B、D组相比P<0.012.2 移植瘤组织中cyclinD1免疫组化检测结果
CyclinD1免疫组化结果显示:cyclinD1抗原主要表达于移植瘤细胞核内,阳性细胞的核被染成棕黄色。各组裸鼠移植瘤组织cyclinD1免疫组化结果比较,见表2。 表2各组裸鼠移植瘤组织抗cyclinD
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免疫组化检测结果比较
组别n阳性细胞百分率(%)范围(%)A组636.32±5.0029.0～42.4B组621.33±6.4310.9～29.1C组623.25±5.6114.7～29.0D组619.42±5.4712.2～28.3 方差分析:F=11.04P<0.01 B、C、D组与A组相比,
P<0.01 B、C、D组两两之间相比P>0.05 提示槲皮素有下调cyclinD1的作用,联合阿霉素用药未明显增强槲皮素对cyclinD1的调控作用。3 讨论 已知槲皮素抗癌防癌的主要机理有:①对抗自由基,抑制脂质过氧化,防止细胞DNA解链断裂[1]。②通过抑制细胞的信号传导,阻断癌细胞的转录等过程,发挥抗肿瘤作用[2]。③抑制RNA聚合酶,尤其是RNA聚合酶Ⅱ,抑制HL260白血病细胞的生长繁殖[3]。④诱导细胞凋亡,槲皮素与高温联合作用可抑制白血病细胞的生长,电镜下可见凋亡小体,电泳分析DNA片段也证实存在细胞调亡[4]。⑤通过与Ⅱ型雌激素结合部位(Ⅱ型EBS)结合,对肺癌细胞和黑色素瘤细胞产生剂量依赖性的抑制作用[5]。 正常细胞周期主要由G1、S、G2和M期组成。G12S相和G22M相转换处各有一个节点(checkpoint),通过对这两个节点的控制可调节细胞周期的进程,使不同的细胞周期事件在时间与空间上相互协调。G0期是暂时脱离细胞周期不进行增殖的时期。G1/S调控点控制从G1期进入S期,其相关基因包括p53、p21WAF1/CIP1、GADD、cyclinD、cyclinE及CDK4等,影响这些基因的表达就会导致细胞周期进展的改变。
・7・肿瘤防治研究2003年第30卷第1期
