逍遥散提取液对乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响

卡培他滨维持治疗联合逍遥散治疗晚期三阴性乳腺癌的临床研究发布时间：2022-12-06T07:06:31.226Z 来源：《健康世界》2022年19期作者：岳明娜[导读] 分析晚期三阴性乳腺癌治疗中联合应用逍遥散与卡培他滨维持治疗的效果。

岳明娜哈尔滨嘉润医院黑龙江哈尔滨150000摘要：目的：分析晚期三阴性乳腺癌治疗中联合应用逍遥散与卡培他滨维持治疗的效果。

方法：晚期三阴性乳腺癌患者取样65例，收治时间2019年12月至2022年03月，随机分为联合组（33例，逍遥散联合卡培他滨维持治疗）和常规组（32例，卡培他滨治疗），对比生存质量、疾病控制率、并发症率。

结果：治疗后，联合组生存质量得分比常规组高，疾病控制率96.97%，比常规组78.13%高，并发症率6.06%比常规组28.13%低，P＜0.05。

结论：晚期三阴性乳腺癌治疗中联合应用逍遥散与卡培他滨维持治疗可优化疾病控制效果，提升治疗安全性，改善患者生存质量。

关键词：晚期三阴性乳腺癌；逍遥散；卡培他滨乳腺癌临床症状以乳头溢乳、腋窝淋巴结肿、乳头肿块、皮肤改变为主，可严重威胁女性心理、生理健康，目前对其的治疗以化疗联合手术为主[1]，而晚期三阴性乳腺癌病人有较高风险发生肿瘤转移或复发情况，单纯给予卡培他滨维持治疗效果有限，为此，本研究取收治时间2019年12月至2022年03月的65例晚期三阴性乳腺癌患者资料，研究观察了逍遥散联合卡培他滨维持治疗的效果。

1.资料与方法1.1一般资料晚期三阴性乳腺癌患者取样65例，收治时间2019年12月至2022年03月，随机分为联合组（33例，逍遥散联合卡培他滨维持治疗）和常规组（32例，卡培他滨治疗）。

纳入标准：KPS＞70 分，无肿瘤远处转移，病理检查、影像学检查确诊，签订同意书的晚期三阴性乳腺癌患者。

排除标准：资料不全，肝、肾、心功能不全者。

联合组1至7年病程，平均（4.14±1.50）年，最高85岁，最低61岁，平均（73.14±3.65）岁，常规组1至7年病程，平均（4.30±1.53）年，最高85岁，最低62岁，平均（73.42±3.60）岁，P＞0.05。

中药对肿瘤细胞周期影响的研究进展孙阳;史默怡;王亚贤【摘要】随着研究技术方法日益先进,中药抗肿瘤的作用机制逐渐被现代医学所揭示.增殖是细胞生命活动的重要特征.细胞的增殖周而复始,构成细胞周期.细胞周期包括G1、S、G2、M期.查阅近年来的相关文献,众多学者应用显微镜、流式细胞术等方法证实抗癌中药阻滞肿瘤细胞于不同的细胞时期.引起细胞阻滞的因素很多,如细胞周期依赖性激酶、细胞周期抑制蛋白和信号通路等.深入研究这些因素,可以探究中药对细胞周期的作用靶点,为更好地在临床上开发、应用中药奠定坚实的基础.%With the advance of technology, the mechanism of action for TCM against tumor has been discovered. Proliferation is an important characteristic of the life, running as cell cycle, which comprises G1 , S, G2 and M phase. Researchers have found that TCM can induce tumor cell to be blocked in certain phase with the help of microscope and flow cytometry. There are many impacting factors for cell block, such as cyclin dependent kinase, cell cycle control protein, signal transduction pathway, etc. The impacting factors of cell block are reviewed and analyzed in this paper. Exploitation of these factors will lay solid foundation for widely clinical application of TCM in curing tumors.【期刊名称】《中医药信息》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】3页(P109-111)【关键词】中药;细胞周期;肿瘤【作者】孙阳;史默怡;王亚贤【作者单位】黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】R285.5增殖是细胞生命活动的重要特征。

实验报告药物A对癌细胞增殖的抑制作用实验报告：药物 A 对癌细胞增殖的抑制作用一、实验背景癌症作为全球范围内严重威胁人类健康的疾病之一，其治疗一直是医学研究的重点领域。

癌细胞的异常增殖是癌症发展的关键环节，因此寻找有效的抑制癌细胞增殖的药物具有重要意义。

药物 A 是一种新型化合物，前期的研究显示其可能具有潜在的抗癌活性，但具体作用机制和效果尚不明确。

本实验旨在探究药物 A 对癌细胞增殖的抑制作用，为其进一步的临床应用提供实验依据。

二、实验材料与方法（一）实验材料1、细胞系：选用了人肺癌细胞系（A549）、人乳腺癌细胞系（MCF-7）和人结肠癌细胞系（HCT116）。

2、药物：药物 A 由本实验室合成，纯度大于 98%。

3、试剂：胎牛血清（FBS）、RPMI 1640 培养基、胰蛋白酶、MTT 试剂等。

（二）实验方法1、细胞培养将三种癌细胞系分别培养在含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中，置于37°C、5% CO2 的培养箱中培养。

待细胞融合度达到80%左右时，进行传代培养。

2、药物处理将处于对数生长期的细胞接种于 96 孔板中，每孔约 5×10³个细胞。

培养 24 小时后，分别加入不同浓度的药物 A（0、1、5、10、20 μM），每个浓度设置 6 个复孔。

继续培养 48 小时。

3、 MTT 法检测细胞增殖培养结束后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），继续培养 4小时。

然后小心吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡 10 分钟，使结晶充分溶解。

使用酶标仪在 490 nm 波长处测定各孔的吸光度值（OD 值）。

4、计算细胞增殖抑制率细胞增殖抑制率＝（对照组 OD 值实验组 OD 值）／对照组 OD值 × 100%三、实验结果（一）药物 A 对不同癌细胞系增殖的影响在三种癌细胞系中，随着药物 A 浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高。

桃儿七提取物对人乳腺癌MCF 【关键词】乳腺癌Effects of Taoerqi extract on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma cell line MCF7【Abstract】 AIM: To investigate the effects and related mechanism of Taoerqi on the proliferation inhibition and onset of apoptosis in breast carcinoma cell line MCF7. METHODS: Antiproliferative effect of Taoerqi extract against MCF7 was tested by MTT assay，morphologic changes of MCF7 were observed by inverted microscope，electron microscope and HE staining， and cell apoptosis percentage and cell cycle phase distribution of MCF7 were measured by flow cytometric assay. The expressions of proliferation and apoptosisassociated proteins were determined by immunocytochemical method. RESULTS: A timedependent and dosedependent proliferation inhibition was demonstrated in Taoerqi extract. With the Taoerqi extract treatment of 1， 2 and 3 mg/L for 72 h， the inhibitory rate was 43.0%， 54.9%， 78.5% respectively. The characteristic morphological changes of apoptosis were observed in cells after treated by 2 mg/L of Taoerqi， and many multinucleate giant cells were also found. Taoerqi induced a G2/M cell cycle arrest and the apoptosis was time and dosedependent. With the treatment of 2 mg/L Taoerqi for 48 h， the protein expressions of PCNA and Bcl2 decreased from (154.78±0.16) and (85.56±0.09) to (78.46±0.15) and (40.43±0.07) (P<0.01)，while p21WAF1/CIP1 and cMyc increased from (92.32±0.12) and (114.48±0.14) to (125.54±0.09) and (156.52±0.08) (P<0.01). CONCLUSION: The timedependent and dosedependent proliferation inhibitory effect of Taoerqi extract on breast cancer cells appears to be caused by the upregulation of p21WAF1/CIP1 expression， downregulation of PCNA expression， and the apoptosis is related to the downregulation of antiapoptotic protein Bcl2 and the upregulation of cMyc protein. G2/M arrest is also associated with apoptosis.【Keywords】 Taoerqi; breast neoplasm; human breast carcinomacell lines MCF7; apoptosis【摘要】目的:研究桃儿七对人乳腺癌MCF7细胞增殖抑制和促进凋亡的作用，探讨其抗癌作用的机制. 方法:应用MTT法检测桃儿七提取物对人乳腺癌MCF7细胞的生长抑制作用，倒置显微镜、HE染色及电镜观察细胞形态学改变，FCM 分析细胞周期及凋亡率，免疫细胞化学法检测细胞增殖凋亡调控相关蛋白的表达.结果:桃儿七提取物可明显抑制MCF7细胞的增殖，1，2，3 mg/L桃儿七作用72 h 后，细胞生长抑制率分别为43.0%，54.9%，78.5%，抑制作用呈时间及浓度依赖性.形态学观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征，伴有多核细胞形成.FCM分析发现桃儿七阻断MCF7细胞生长于细胞周期的G2/M期，凋亡诱导作用呈时间及浓度依赖性.免疫细胞化学结果显示，2 mg/L桃儿七作用48 h后，PCNA，Bcl2蛋白表达分别由154.78±0.16，85.56±0.09降至78.46±0.15，40.43±0.07，P<0.01；而p21WAF1/CIP1和cMyc蛋白由92.32±0.12，114.48±0.14增至125.54±0.09，156.52±0.08，P<0.01. 结论:桃儿七提取物对人乳腺癌MCF7细胞的生长有明显的呈时间及浓度依赖性的抑制作用，G2/M期阻滞并诱导凋亡. 该作用与p21WAF1/CIP1表达增加及PCNA表达降低有关，通过下调Bcl2和上调cMyc表达诱导乳腺癌细胞凋亡.【关键词】桃儿七;乳腺癌;人乳腺癌细胞系MCF7;凋亡0引言藏药桃儿七又名小叶莲，藏药音译奥色塞，习用果实. 宗玉英等［1］发现桃儿七果实900 mL/L乙醇提取物对肿瘤细胞抑制率为75%，目前对于其抗肿瘤作用机制仍不很清楚. 我们对桃儿七根900 mL/L乙醇提取物抑制乳腺癌细胞增殖及其诱导凋亡的作用机制进行研究如下.1材料和方法1.1材料乳癌细胞MCF7由第四军医大学分子生物学室惠赠. 小牛血清，RPMI 1640培养基（Gibco公司）;噻唑蓝（MTT，上海生工生物制品公司）;二甲基亚砜（DMSO）;p21WAF1/CIP1，cMyc，Bcl2，PCNA鼠抗mAb，SABC及DAB试剂盒（博士德公司）. 酶标仪（奥地利Tecan）;相差倒置显微镜（Olympus CK4032RPC）;流式细胞仪（美国Coulter Elite Esp型）;投射电镜（JEM2000EX 日本）. 取桃儿七根粗粉100 g，以石油醚（30~60℃）浸提至无色，药渣再以900 mL/L乙醇浸提至无色，乙醇回收溶剂，减压蒸馏获得浸膏，真空低温干燥，制得样品.样品先以少量DMSO溶解，然后用双重蒸馏水稀释配制为20 mg/mL的原液，用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌后-20℃避光保存，临用前再以RPMI 1640完全培养基稀释配成不同药物浓度，DMSO在溶液中最大浓度小于0.05%.1.2方法1.2.1细胞生长状态取对数生长期细胞常规消化接种于96孔培养板（3×103个/孔），每孔200 μL，培养24 h后弃去培养液，随机分为5组(每组n=8)，实验组加入含不同浓度桃儿七根乙醇提取物的RPMI 1640完全培养基200μL，终浓度为（1，2，3 mg/L）；阴性对照组加等量RPMI 1640培养液；阳性对照组为顺铂（PDD） 3 mg/L.分别于加药后24，48和72 h加入MTT (5 g/L) 20μL继续培养4 h，弃培养液，每孔加150 μL DMSO，设置空白对照，振荡混匀10 min，上酶标仪检测A值，检测波长490 nm，参考波长640 nm.抑制率(%)=（1-实验组A/对照组A）×100. 倒置显微镜动态观察细胞形态变化.取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于置有载玻片的6孔板培养皿，细胞贴壁后弃上清，用药组加入含2 mg/L桃儿七的RPMI 1640的培养液共孵育，同时设对照组，48 h后行常规HE 检查.再将6×105经2 mg/L桃儿七作用后24 h及48 h的MCF7细胞浸入4℃冰冷的40 g/L戊二醛固定2 h，用探针剥离细胞团块，移入小瓶，常规电镜脱水，包埋，双铅染色，制备超薄切片，电子染色，透射电镜观察细胞超微结构.1.2.2细胞周期及凋亡取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于50 mL培养瓶(3×105个/瓶)，24 h后实验组加入含不同浓度桃儿七根乙醇提取物的培养液，对照组以等量RPMI 1640代替样品，常规培养，分别于加药后24，48 h常规消化，10 mmol/L PBS洗涤离心两次，取1×106个细胞，70 mL/L冷乙醇固定过夜，再用PBS洗去固定液，加碘化丙啶(PI)染色液1 mL(含0.25 g/L RNase A，20 mg/L PI)，置于4℃冰箱30 min后上流式细胞仪检测DNA含量，每组共测1×104个细胞.同时取1×106个细胞重悬于预冷的结合缓冲液，调整细胞数为1×109/L，加入5 μL Annexin VFITC和5 μL PI到490 μL细胞悬液中，4℃避光孵育10 min，流式细胞仪检测荧光强度，每组共测1×104个细胞.1.2.3免疫组化取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于置有载玻片24孔板的培养皿，实验组加入含2 mg/L浓度桃儿七根90 mL/L乙醇提取物，对照组加等量1640培养液，常规培养，于加药后48 h终止培养，取出爬有细胞的玻片，10 mmol/L PBS冲洗3次，950 mL/L乙醇固定15 min，染色步骤严格按SABC，DAB 试剂盒说明书操作，以PBS代替一抗作阴性对照，检测Bcl2，cMyc，PCNA及p21WAF1/CIP1蛋白表达.染色结果判断：MCF7细胞核或(和)胞质呈棕褐色为阳性，高倍视野下随机计数5个视野细胞总数，计数其中的阳性细胞，算出阳性率，并用病理图像分析软件对蛋白表达进行半定量分析.统计学方法：计量资料用x±s表示，计数资料用％表示，采用SPSS 10.0统计软件包作数据处理，分别采用秩相关分析，方差分析，t检验.P<0.05表示差异有统计学意义.2结果2.1桃儿七对MCF7细胞生长的抑制作用对照组MCF7细胞体外生长活跃，桃儿七对MCF7细胞有明显的抑制作用，1 mg/L 48 h出现细胞生长抑制，与对照组比较有统计学意义(P<0.01)，而2和3 mg/L 24 h出现极显著的差异（P<0.01），并且随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，并呈时间、浓度依赖性，经秩相关分析γs=0.75，P<0.05. 1，2，3 mg/L桃儿七作用72 h后，细胞生长抑制率分别为43.0%，54.9%，78.5%，阳性对照组PDD 3 mg/L为58.6%（Tab 1）.表1桃儿七对MCF7细胞的影响（略）2.2肿瘤细胞形态学变化加桃儿七后细胞膜皱缩，细胞先变圆，原来贴壁生长的细胞脱离生长面，呈悬浮状态，且随药物浓度增大及时间延长，细胞悬浮增多.HE染色后光镜下凋亡细胞核呈致密深蓝色，核浓缩，核染色质固缩致密或断裂（Fig 1），另有部分细胞体积变大，出现较多多核细胞，并有多级分裂出现.用药24 h后，透射显微镜下可见凋亡细胞膜表面微绒毛减少或消失，核染色质边集及凝聚，核形态不规则，线粒体结构基本清晰，有些内质网空泡变形，另有许多多核细胞（Fig 2），48 h后，部分胞核染色质固缩沿核膜分布，有的核膜部分消失，另见坏死细胞.2.3细胞周期分布桃儿七作用24 h后MCF7细胞明显阻滞在G2/M期，并呈浓度依赖性，而G0/G1， S期明显减少（Tab 2）；2 mg/L桃儿七作用细胞48 h，S期细胞逐渐增多，增殖渐趋活跃，G2/M期细胞仍高，G0/G1期仍低.表2桃儿七作用24 h后FCM检测细胞周期（略）2.4细胞凋亡桃儿七有诱导细胞凋亡作用. 药物作用24 h后，Annexin V+细胞及Annexin V/PI双阳细胞逐渐增加.48 h后对照组Annexin V+细胞为0.2%，Annexin V/PI双阳细胞为1.0%，2 mg/L桃儿七组Annexin V+细胞为23.1%，Annexin V/PI双阳细胞为15.3%，说明随着药物浓度增高及作用时间的延长，早期凋亡细胞及继发性坏死细胞均增加（Tab 3）.表3桃儿七作用24 h Annexin V/PI双染色结果（略）2.5免疫组化MCF7细胞中PCNA，p21WAF1/CIP1，cMyc蛋白表达定位于胞核，Bcl2蛋白表达定位于细胞质，细胞均100%阳性表达. 2 mg/L桃儿七作用于细胞48 h后，PCNA（Fig 3）， Bcl2表达下降，cMyc，p21WAF1/CIP1蛋白表达增加（Tab 4），与对照组相比，有统计学意义(P<0.01).表4桃儿七对PCNA，p21WAF1/CIP1，cMyc，Bcl2蛋白表达影响（略）3讨论桃儿七果实乙醇提取物对多种肿瘤细胞具杀伤作用［1］，但其抗肿瘤机制不明. 本结果表明，桃儿七对MCF7细胞有明显的抑制作用，并呈时间、浓度依赖性. 桃儿七还有G2/M期阻滞作用及凋亡诱导作用. 许多研究显示G2M期阻滞与凋亡有关［2］. 桃儿七可引起细胞出现凋亡，肿瘤主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少［3］. Bcl2是公认的抗凋亡基因，多种肿瘤高表达Bcl2，并通过Bcl2发挥抗凋亡作用［4］. cmyc基因表达产物具有双向性，其引起的细胞凋亡可被Bcl2的过表达所抑制.ICC结果显示，2 mg/L桃儿七作用于细胞48 h后，Bcl2蛋白表达下调，cMyc蛋白表达上调，说明下调Bcl2蛋白表达及上调cMyc蛋白表达可能为桃儿七诱导MCF7细胞凋亡的机制之一. PCNA不仅参与DNA 的合成，而且与cyclin，CDK，p21形成四聚体，调控周期和增殖，其表达高低可作为细胞增殖的指标［5］.p21WAF1/CIP1是p53下游的调节基因，最近研究表明G2/M节点的改变也与p21WAF1/CIP1的表达有关［6］.ICC结果显示，2 mg/L桃儿七作用于细胞48 h后，与对照组相比，PCNA蛋白表达下调，p21WAF1/CIP1蛋白表达上调，这可能为桃儿七抑制MCF7细胞增殖抑制的机制之一. 本实验对桃儿七抗肿瘤作用机制及其开发利用提供了一定的理论依据.【参考文献】［1］刘海军，徐艳，苏国庆，等. 桃儿七的研究进展［J］. 中草药，2004; 35(1): 98-100.Liu HJ， Xu Y， Su GQ， et al. Progresses in the study of Sinopodofhyllum emodi Ying［J］. Chin Tradit Herb Drugs， 2004; 35(1): 98-100.［2］ DiPaola RS. To arrest or not to G2M cell cycle arrest ［J］. Clin Cancer Res， 2002; 8(11):3311-3314.［3］ Hoeijmakers JH. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer ［J］. Nature， 2001; 411(6835): 366-374.［4］丁磊，袁建林，武国军，等.Bcl2及Bag1基因产物在肾癌组织中的表达及意义［J］. 第四军医大学学报，2002；23（14）：1303-1305.Ding L， Yuan JL， Wu GJ， et al. Expression and significance of Bcl2 and Bag1 in renal cell carcinoma ［J］. J Fourth Mil Med Univ，2002; 23（14）：1303-1305.［5］郑建勇，李开宗，王为忠. p27kip2与肝癌细胞增殖和凋亡的关系［J］. 第四军医大学学报，2003；24（15）：1359-1361.Zheng JY， Li KZ， Wang WZ. Relationship between p27kip2 and cellular proliferation and apoptosis in hepatocellular carcinoma ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003; 24(15): 1359-1361.［6］ Ha MW， Hou KZ， Liu YP， et al. Effect of staurosporine on cycle of human gastric cancer cells ［J］. World J Gastroenterol，2004; 10(2): 161-166.。

《新型砷代谢产物联合隐丹参酮对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用研究》篇一一、引言乳腺癌作为全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其治疗手段和预后一直是医学界研究的热点。

近年来，随着药物研究的深入，越来越多的研究关注于天然药物及其活性成分在抗肿瘤领域的应用。

其中，砷代谢产物和隐丹参酮因其独特的药理作用和较低的毒副作用，备受关注。

本研究旨在探讨新型砷代谢产物与隐丹参酮联合作用对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响，以期为乳腺癌的治疗提供新的思路和方法。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料包括新型砷代谢产物、隐丹参酮以及人乳腺癌MCF-7细胞株。

所有试剂均为高纯度，并经过严格的质量控制。

2. 方法（1）细胞培养：采用标准细胞培养技术，将MCF-7细胞培养于含有适当营养物质的细胞培养基中。

（2）药物处理：将新型砷代谢产物与隐丹参酮分别以不同浓度处理MCF-7细胞，并设置对照组。

（3）细胞凋亡检测：采用流式细胞术、Western blot等方法检测细胞凋亡情况。

（4）数据分析：对实验数据进行统计分析，绘制图表。

三、实验结果1. 细胞生长抑制实验结果显示，新型砷代谢产物与隐丹参酮联合处理MCF-7细胞后，细胞生长受到明显抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强。

2. 细胞凋亡诱导流式细胞术检测结果显示，新型砷代谢产物与隐丹参酮联合处理MCF-7细胞后，细胞凋亡率显著增加。

Western blot结果显示，凋亡相关蛋白的表达也发生了明显变化。

3. 联合作用效果实验发现，新型砷代谢产物与隐丹参酮联合作用时，对MCF-7细胞的抑制和促凋亡作用较单独使用其中一种药物更为显著。

这表明两者在抗肿瘤方面具有协同作用。

四、讨论本研究结果表明，新型砷代谢产物与隐丹参酮联合作用能够显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞的生长并诱导其凋亡。

这一发现为乳腺癌的治疗提供了新的思路和方法。

在讨论部分，我们首先分析了新型砷代谢产物的抗肿瘤机制，包括对细胞周期、凋亡途径的影响等。

中医药防治三阴乳腺癌研究进展苏菲;万冬桂;刘芳;贾立群;张艳华;王娟;娄彦妮【摘要】乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型及三阴型,不同分子分型在治疗、预后上存在差异,三阴乳腺癌为乳腺癌的一种分型,临床特点为ER、PR、HER2均为阴性,三阴乳腺癌对内分泌治疗和分子靶向治疗均不敏感,预后相对较差,因此探索积极有效的中医治疗可以提高患者的生存期并改善预后.三阴乳腺癌中医辨证可分为肝郁痰凝证、冲任失调证和正虚毒炽证及其他证型,根据不同辨证分型对症用药可以减缓疾病进展及防治放化疗不良反应.临床及试验研究均证实,对于晚期三阴乳腺癌患者除放化疗外,中医药治疗是一种可选的有效方法,中医辨证论治遣药组方可以扶正抑瘤,达到中西医结合优势互补的作用.【期刊名称】《中国中医基础医学杂志》【年(卷),期】2018(024)011【总页数】3页(P1649-1651)【关键词】中医;三阴乳腺癌;辨证论治【作者】苏菲;万冬桂;刘芳;贾立群;张艳华;王娟;娄彦妮【作者单位】中日友好医院,北京 100029;中日友好医院,北京 100029;中日友好医院,北京 100029;中日友好医院,北京 100029;中日友好医院,北京 100029;中日友好医院,北京 100029;中日友好医院,北京 100029【正文语种】中文【中图分类】R737.9乳腺癌发病率在中国居高不下，国家癌症中心统计数据表明，乳腺癌占全部女性恶性肿瘤的16.81%，并以3%～4%的速度逐年增长[1]。

三阴乳腺癌占乳腺癌12%～17%，表现为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER2)在免疫组化检测时均为阴性，作为乳腺癌亚型，因其对HER2基因起作用的分子靶向治疗和对ER/PR起作用的内分泌治疗均不敏感，化疗后远期生存率尚不明确，临床转移率及病死率较高，预后不佳[2]。

中医药因其独特的辨证论治体系和个体化特色，为三阴乳腺癌的患者增加了选择性治疗方案和措施。

第20卷第2期2001年3月 无锡轻工大学学报Journal of Wuxi U niversity of Light Industry Vol.20,No.2Mar.,2001　文章编号:1009-038X (2001)02-0205-03 收稿日期:2000-03-25;修订日期:2000-11-09.作者简介:唐莉莉(1964-),女,江苏无锡人,工学硕士,副教授.柠檬苦素类化合物对人乳腺癌细胞(MCF 27)的生长抑制及细胞周期动力学的影响唐莉莉1,　曾祥斌2,　田庆国1,　丁霄霖1(1.无锡轻工大学食品学院,江苏无锡214036;2.上海医科大学公共卫生学院,上海200032)摘　要:为了探讨柠檬苦素类似物对乳腺癌细胞MCF 27生长抑制和对细胞周期的影响,应用M TT 法和流式细胞仪检测癌细胞株生长和细胞周期.结果显示柠檬苦素类似物能明显抑制MCF 27的生长,抑制率高于70%,并随作用时间和剂量增加其效果增强;柠檬苦素可以影响细胞周期G 2/M 期.柠檬苦素类似物可以明显抑制MCF 27的增殖,并有可能是通过阻滞细胞在G 2/M 期而降低其生长能力.关键词:柠檬苦素类似物;乳腺癌细胞;生长抑制;细胞周期中图分类号:TS 218 文献标识码:AThe E ffect of Limonoid on the G row th 2Inhibition and Cell Cycleof H uman Mammary C ancer Cell Line(MCF 27)TAN G Li 2li 1,　ZEN G Xiang 2bin 2,　TIAN Qing 2guo 1,　DIN G Xiao 2Lin 1(1.School of Food Science &Technology ,Wuxi Light Industry University ,Wuxi 214036,China ;2.School of Public health ,Shanghai Medical University ,Shanghai 200032,China )Abstract :To explore the effect of Limonoid on the growth 2inhibition and cell cycle of human mamma 2ry cancer cell lines (MCF 27),the growth and cell cycle of MCF 27were detected by M TT assay and FCM.The Limonoid can inhibit the growth of MCF 27.The rate of inhibition was morn than 70per 2cent and related to does and times.The cells show G 2/M arrest.Limonoid has effects on inhibiting MCF 27,and the mechanism of action may be associated with influence of the G 2/M arrest.K ey w ords :limonoid ;human mammary cancer cell ;growth 2inhibition ;cell cycle 柠檬苦素类化合物(li monoi d )是三萜类的植物次生代谢产物,主要存在于芸香科(R utaceae )和柬科(Meliaceae )植物中,尤其在柑桔属(Cit rus )的种子及皮中含量丰富,迄今为止,已发现300余种柠檬苦素类似物.柠檬苦素类似物是引起桔汁苦味的主要原因之一[1],最近的研究表明,柠檬苦素类似物可以激活体内主要的解毒酶谷胱甘肽S 2转移酶的活性,大量的动物试验也表明,柠檬苦素类化合物可以抑制由化学物质引起的肝癌、小肠癌、口腔癌和胃癌等[2～4].作者报道了柠檬苦素类似物对人乳腺癌细胞MCF 27的抑制作用及可能机制.1　材　料1.1　细胞株人类乳腺癌细胞株MCF27,购自中科院上海细胞生物学研究所.1.2　主要试剂RPM I21640、胰蛋白酶为G iboc产品;二甲亚砜(DMSO)和噻唑蓝(M TT)为Sigma产品;细胞培养基为含10%胰岛素、10%小牛血清并加入双抗的RPM I21640培养基柠檬苦素类似物样品由无锡轻工大学田庆国博士提供.1.3　主要器材流式细胞仪FACS Calibur,美国Becton Dickin2 son公司产品;Bio2Tek全自动酶标分析仪、96孔培养板,美国Corning2Coster公司产品.2　方　法2.1　柠檬苦素类似物溶液的制备柠檬苦素类似物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,配成100mg/mL储存液于-20℃备用.临用前用培养液配成500μg/mL,4倍递减稀释.2.2　细胞生长抑制实验(MTT法)用0.25%胰蛋白酶消化培养细胞,用含10%胎牛血清的RPM I1640培养液配成单个细胞悬液,以每孔1.0×104细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200μL.将培养板移入CO2培养箱中,在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养.培养结束后,每孔加入M TT溶液(5mg/mL)20μL,37℃继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液.每孔加入150μL DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解.选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,每浓度设3个平行孔.2.3　柠檬苦素对细胞周期的影响将乳腺癌细胞按5×105密度接种于60mL培养瓶中,24h后,加入不同剂量的柠檬苦素,染毒时间为24h,染毒结束后,胰酶消化,细胞放置37℃水浴,PBS洗一遍,离心加入0.1%TritonX2100的PBS,室温放置3min,PBS洗二遍,调节细胞每管106,RNase处理37℃水浴15min,离心后加入溴化丙啶(PI,15μg/mL),放置暗处1h后上机,上机前用滤网过滤.采集3000个细胞,用ModFit软件分析细胞周期各时相百分比例.3　结　果3.1　不同剂量柠檬苦素类似物对癌细胞生长抑制的影响 培养48h后M TT测定,测定结果表明,柠檬苦素类似物能够有效地抑制MCF27细胞生长,且有剂量效应关系,5种样品高剂量组的抑制率均超过70%,见图1.图1　柠檬苦素类似物对癌细胞存活率的影响Fig.1　The effect of limonoid on the livability of human mammary cancer cell line MCF273.2　作用天数对细胞存活率的影响 为观察作用时间对细胞存活率的影响,分别测定作用24、48、36h后癌细胞的存活率.图2可见,作用时间与存活率呈负相关.图2　作用时间对细胞存活率的影响(样品质量浓度为30mg/mL)Fig.2　The effect of time on the livability of cells(the concentration is30g/mL3.3　柠檬苦素对乳腺癌细胞周期动力学的影响 收集对照组及柠檬苦素剂量组MCF27细胞进行流式细胞仪测试,结果见表1.G0/G1、S期细胞602 无　锡　轻　工　大　学　学　报 第20卷减少,G 2/M 期细胞增多,这个结果提示,柠檬苦素通过阻滞细胞在G 2/M 期来抑制MCF 27细胞的增殖.表1　柠檬苦素对乳腺癌细胞周期动力学的影响T ab.1　The effect of limonoid on the cell cycle of human质量浓度/(μg/mL )(G 0/G 1)/%S /%(G 2/M )/%1062.1029.348.572059.6030.749.653054.4633.9711.574059.1426.5114.355057.4825.4917.034　结　论乳腺癌是发达国家的高发生率疾病,每年以2%的速率递增[5].目前,我国也呈高增长趋势.流行病学调查显示,植物性食物可以一定程度上减少乳腺癌的危险性.因此,寻求食物中的效抗癌因子已成当今保健的新时尚.我国自古以来就有用柑桔之成分治病的历史,对柠檬苦素类似物最初的研究是为了将其从柑桔中除去,以提高柑桔制品的商品价值.而现在已注意到柠檬苦素类似物的生物学活性作用.作者研究显示,柠檬苦素类似物在体外能显著抑制人乳腺癌细胞MCF 27的生长,且存在剂量效应关系.正常的细胞周期是细胞进行正常代谢和增殖过程的重要保证,细胞周期各时相参数的改变,将干扰和破坏细胞的正常功能,并因此达到抑制癌细胞生长的目的.用柠檬苦素处理乳腺癌细胞后观察各时相细胞增殖周期的移行变化,发现柠檬苦素能影响MCF 27细胞周期,G 1、S 期细胞减少,G 2/M 期细胞增多,显示柠檬苦素通过阻滞细胞在G 2/M 期来抑制MCF 27细胞的增殖.细胞周期中有两个最为基本的调控点,一个位于G 1期和S 期的过渡时期,决定着是否进入细胞周期;另一个位于G 2与M 期之间,又叫G 2/M 过渡点.G 2/M 期阻滞可能也是DNA 的修复期,使损伤DNA 在染色体分离前得到修复,不能修复者则退出增殖周期,进入凋亡途径.本次研究也观察到用柠檬苦素处理48h 后出现凋亡细胞.柠檬苦素类似物作为天然抗癌剂的实际应用还有待于更全面的研究.开展柑桔中柠檬苦素类似物的研究,对提取更多的生物活性物质和开发更多的功能性食品,很有探索价值.参考文献:[1]CHAAMPA GN E D E ,KOUL O ,ISMAN M B ,et al.Biologiacal activity of limonoids from the rutales[J ].Phytochemistry ,1992,31:377～394.[2]LAM L kt ,L I Y ing ,HASEG AWA S.E ffect of cetrus limonoids on glutaathione S 2transferase activity in mice[J ].J Agric FoodChem ,1989,37:878～880.[3]MILL ER E G ,FANOUS R ,RIV ERA 2HIDAL G O F ,et al.The effect of cetrus limonoids on hamster buccal pouch carcinogen 2esis[J ].C arcinogenisis ,1989,10:1535～1537.[4]MIL IER E G ,G ONZAL ES 2SANDERS A P ,COUV ILLON A ,et al.Inhibition of hamster buccal ppuch carcinogenesis bylimonin 172β2D 2glucopyranoside[J ].Nutr C ancer ,1992,17:1～7.[5]PISAN I.Breast Cancer :G eographic Variation and Risk Factors [J ].J E nviron P athol Toxicol Oncol ,1992,11:313～316.(责任编辑:朱明)702第2期唐莉莉等:柠檬苦素类化合物对人乳腺癌细胞(MCF 27)的生长抑制……。