3,5二硝基水杨酸比色法测定糖的含量

生物化学实验示范报告：3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线；马铃薯总糖含量测定

第 1 页 共 3 页 实验二 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线

马铃薯总糖含量测定

实验目的

1. 熟悉并掌握7200型分光光度仪的结构及工作原理和操作使用方法；

2. 掌握分光光度法测定物质含量的基本操作步骤及微机绘制标准曲线的操作方法；

3．掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的原理及方法；

4．掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理与方法。

实验原理

1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的及标准曲线定制原理

3,5-二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中加热反应后被还原成棕红色的氨基化合物，该有色物质在540nm 处有最大吸光度，且在一定浓度范围内（一般OD值在0.2～0.8范围内线性较好），还原糖的量与反应液的颜色强度（吸光度OD值）呈线性关系，利用分光光度仪，以分析纯葡萄糖为还原糖测定的标准品，在540nm处按梯度依次测定各葡萄糖浓度对应的反应液的吸光度（OD值）大小，通过微机处理数据，定制葡萄糖标准曲线，确定出3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的线性回归方程；

2. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理

先将马铃薯去皮，经机械粉碎，过滤和清水漂洗，烘干制成马铃薯淀粉；再精确称取干燥恒重后的马铃薯淀粉加酸水解为还原糖，经中和定容，配制成马铃薯总糖含量测定的待测液（即样品液）；再以标准曲线测定的加样操作方法，测定出样品待测液的吸光度大小，将测定的吸光度大小代入其回归方程，即可计算出样品待测液的显色浓度，根据稀释倍数关系，计算出以还原糖的量表示的马铃薯总糖的量，并测定出马铃薯总糖百分含量。该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。

实验操作

1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线

3,5-二硝基水杨酸(dns)法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量

3,5-二硝基水杨酸法是常用的测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量的方法。该方法操作简便、灵敏度高、重现性好。具体步骤如下：

1. 样品制备：取适量甘蔗茎节，去除表皮和髓部，仅留下髓骨。将髓骨切成小丁块，加入清水，煮沸5分钟，离火冷却后离心取上清，过滤掉杂质，即为样品。

2. 取样：取样品5mL，加入试管中。

3. 加试剂：加入2mL DNS试剂，混匀。

4. 加热：将试管放在沸水中加热10分钟。

5. 冷却：取出试管，放置至室温下冷却。

6. 吸光度测定：利用分光光度计测定样品的吸光度。

7. 计算含量：根据标准曲线计算出样品中总糖和还原糖的含量。

总糖和还原糖含量的计算公式如下：

总糖含量（%）=（样品吸光度值-对照吸光度值）×标准糖液浓度×20/样品量（mL）

还原糖含量（%）=（样品吸光度值-对照吸光度值）×标准还原糖液浓度×20/样品量（mL）

上海大学生命科学实验中心

实 验 预 习 报 告

课 程： 姓 名： 日 期：

学 号： 同组者： 指导老师：

实验时间： 温 度： 湿 度：

（一律用A4纸、钢笔书写或打印，不得涂改，经教师签字后方为有效，附在实验报告中一并交。如无此原始记录或丢失，报告不批示成绩）

【实 验 名 称】：3，5-二硝基水杨酸比色定糖

【实验目的】：1.掌握3，5-二硝基水杨酸法定糖的原理及方法。

2.熟悉分光光度计的原理及使用方法。

【实验原理】：还原糖指含有自由醛基和酮基的糖类。双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。在520nm波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

【实验仪器及试剂】 仪器：移液枪，各规格移液管，分光光度计，烧杯，试管，100ml容量瓶，AL104电子天平，量筒，搅拌棒，恒温水浴箱，25ml比色管

试剂：分析纯葡萄糖，蒸馏水，3,5-二硝基水杨酸，2mol/L NaOH溶液，酒石酸钾钠，结晶酚，亚硫酸钠

【实验操作】（1） 配制1mg.mL-1葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

（2） 配制3,5-二硝基水杨酸试剂：准确称量6.3g 3,5-二硝基水杨酸和量取262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量

3,5-二硝基水杨酸法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法，其原理基于还原糖在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物，而总糖则在强硫酸存在下加热分解，生成由葡萄糖和六碳糖等组成的还原糖，在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物。

具体操作步骤如下：

1. 取一定质量的山楂片粉末，加入适量的蒸馏水，加热水浴至沸腾，过滤，将过滤液冷却至室温。

2. 取0.2 ml 过滤液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。

3. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，还原糖含量的计算公式为：还原糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。

4. 取剩余过滤液，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，浸于沸水中煮2小时，浸于水中冷却，并用蒸馏水将瓶口水洗入容量瓶，摇匀。 5. 取0.1ml 还原糖水样稀释液加入容量瓶，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，摇匀后加入适量的蒸馏水到刻度线，摇匀后离心。

6. 取0.1 ml 离心上清液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。

7. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，总糖含量的计算公式为：总糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。

总之，3,5-二硝基水杨酸法是一种稳定可靠的方法，能够准确测定山楂片中的还原糖和总糖含量，为山楂片的质量控制提供了重要的参考。