生物化学实验报告示范-3-5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线

实验二3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线马铃薯总糖含量测定实验目的1. 熟悉并掌握7200型分光光度仪的结构及工作原理和操作使用方法；2. 掌握分光光度法测定物质含量的基本操作步骤及微机绘制标准曲线的操作方法；3．掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的原理及方法；4．掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理与方法。

实验原理1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的及标准曲线定制原理3,5-二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中加热反应后被还原成棕红色的氨基化合物，该有色物质在540nm 处有最大吸光度，且在一定浓度范围内（一般OD值在0.2～0.8范围内线性较好），还原糖的量与反应液的颜色强度（吸光度OD值）呈线性关系，利用分光光度仪，以分析纯葡萄糖为还原糖测定的标准品，在540nm处按梯度依次测定各葡萄糖浓度对应的反应液的吸光度（OD值）大小，通过微机处理数据，定制葡萄糖标准曲线，确定出3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的线性回归方程；2. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理先将马铃薯去皮，经机械粉碎，过滤和清水漂洗，烘干制成马铃薯淀粉；再精确称取干燥恒重后的马铃薯淀粉加酸水解为还原糖，经中和定容，配制成马铃薯总糖含量测定的待测液（即样品液）；再以标准曲线测定的加样操作方法，测定出样品待测液的吸光度大小，将测定的吸光度大小代入其回归方程，即可计算出样品待测液的显色浓度，根据稀释倍数关系，计算出以还原糖的量表示的马铃薯总糖的量，并测定出马铃薯总糖百分含量。

该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。

实验操作1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线（1）葡萄糖标准溶液的配制：（2mg/mL）准确称取2000mg分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至1000mL，冰箱保存备用（2）葡萄糖标准曲线定制加样操作及测定结果纪录（详见表1）按表1进行实验操作，在沸水浴中准确反应20min，取出后立即用冷水冷却，加蒸馏水定容至25mL，摇匀，用lcm的比色杯于540nm处测光密度值。

一、实验目的1. 理解血糖测定的原理和方法。

2. 学习并掌握3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖的原理。

3. 建立血糖标准曲线，用于未知血糖样品的定量分析。

二、实验原理本实验采用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖。

该法基于葡萄糖的还原性，在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与葡萄糖反应生成棕红色化合物。

通过测定该化合物的吸光度，可以计算出葡萄糖的浓度。

三、实验器材1. 实验室天平2. 100ml容量瓶3. 移液管4. 烧杯5. 恒温水浴锅6. 分光光度计7. 3,5-二硝基水杨酸试剂8. 氢氧化钠溶液9. 标准葡萄糖溶液10. 未知血糖样品四、实验步骤1. 配制标准葡萄糖溶液：- 准确称取1.0g无水葡萄糖，溶解于100ml蒸馏水中，配制成10mg/ml的标准葡萄糖溶液。

- 分别取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0ml标准葡萄糖溶液，加入9.5ml蒸馏水，配制成浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的系列标准溶液。

2. 显色反应：- 向每个标准溶液中加入1.5ml 3,5-二硝基水杨酸试剂和1.5ml氢氧化钠溶液。

- 将混合液置于沸水浴中加热5分钟。

3. 吸光度测定：- 冷却后，用分光光度计在540nm波长下测定各溶液的吸光度。

4. 绘制标准曲线：- 以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

5. 未知血糖样品测定：- 按照步骤2和3对未知血糖样品进行显色反应和吸光度测定。

- 根据标准曲线，计算未知血糖样品的葡萄糖浓度。

五、实验结果1. 标准曲线绘制：- 通过实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程为：A = 0.0568C + 0.0031（R² = 0.9986）。

2. 未知血糖样品测定：- 对未知血糖样品进行测定，得到吸光度为0.85。

- 根据标准曲线，计算未知血糖样品的葡萄糖浓度为1.7mg/ml。

六、实验讨论1. 3,5-二硝基水杨酸法是一种简单、快速、灵敏的血糖测定方法，适用于临床和科研领域。

35二硝基水杨酸比色定糖法实验报告35二硝基水杨酸比色定糖法实验报告一、引言糖是生命体内重要的能量来源之一，因此糖的检测对于生物学和医学研究具有重要意义。

35二硝基水杨酸比色定糖法是一种常用的糖类检测方法，本实验旨在通过该方法测定不同浓度的葡萄糖溶液。

二、实验原理35二硝基水杨酸（DNS）与糖类在碱性条件下反应生成有色产物，其吸光度与糖的浓度成正比。

在实验中，将待测样品与DNS溶液混合，加热反应后冷却，然后用紫外可见分光光度计测定吸光度，通过标准曲线可以计算出样品中糖的浓度。

三、实验步骤1.准备工作：将DNS溶液配制成适当浓度，标定不同浓度的葡萄糖溶液。

2.制备标准曲线：取一系列含有不同浓度葡萄糖的试管，分别加入适量DNS溶液，并用水稀释至一定体积。

将试管放入沸水中加热，反应5分钟后取出冷却至室温。

用紫外可见分光光度计测定吸光度，并记录数据。

3.测定待测样品：将待测样品与DNS溶液混合，按照步骤2中的方法进行反应和测定吸光度。

4.计算结果：利用标准曲线中的吸光度与浓度的关系，计算出待测样品中糖的浓度。

四、实验结果与讨论在本实验中，我们制备了一系列含有不同浓度葡萄糖的标准溶液，并利用35二硝基水杨酸比色定糖法测定了其吸光度。

通过绘制标准曲线，我们得到了吸光度与浓度之间的线性关系。

在测定待测样品时，我们按照相同的方法进行了实验，并测定了其吸光度。

通过标准曲线，我们可以计算出待测样品中糖的浓度。

实验结果显示，不同浓度的葡萄糖溶液在吸光度上呈现出明显的差异，与理论预期相符。

然而，在实际操作中，我们也遇到了一些问题。

首先，溶液的pH值对实验结果有一定影响，因此在实验过程中需要严格控制溶液的pH值。

其次，反应温度和时间也会对实验结果产生影响，需要进行优化。

此外，实验中使用的DNS 溶液也需要事先标定，以确保准确的测量结果。

五、结论通过35二硝基水杨酸比色定糖法，我们成功测定了不同浓度的葡萄糖溶液中糖的浓度。

标准准葡萄糖DNS比色法测定的方法采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定水解液中还原糖含量，用752型分光光度计进行比色测定。

1葡萄糖DNS比色法的测定原理3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被的还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。

2测试药品（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3测试方法（1）葡萄糖标准曲线制作①按下表制备9个试管。

②向9支试管中分别加入DNS试剂0.5ml，充分混合。

③将9支试管放入沸水浴中加热煮沸5min。

④将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。

⑤向各管中分别加入4mL蒸馏水，充分混合。

⑥以空白（1＃）管做对照，用分光光度计于540nm波长下分别测定各管溶液的OD值。

⑦以每管在540nm下的吸光值为纵坐标，每管所含的葡萄糖浓度为横坐标作图，即可得到一条通过零点的直线。

如果直线不通过零点则需重做。

标准葡萄糖曲线浓度的量取Tab.2.2 Preparation on standard curve of glucose试管编号标准葡萄糖溶液(mL) 蒸馏水(mL) 最终浓度(mg/mL)1 0 0.5 02 0.05 0.45 0.13 0.1 0.4 0.24 0.15 0.35 0.35 0.2 0.3 0.46 0.25 0.25 0.57 0.3 0.2 0.68 0.35 0.15 0.7 90.40.10.8（2）测定步骤①样品稀释。

②取2支试管，其中一支做对照，向样品试管中加入稀释后的样品溶液0.5mL ，空白不加。

③向两支试管中分别加入DNS 试剂0.5ml ，于沸水浴中加热5min ，然后冷却。

还原糖和总糖含量的测定（3，5 一二硝基水杨酸比色法）还原糖和总糖含量的测定（3 ，5 一二硝基水杨酸比色法）作者：佚名文章来源：生物化学实验技术点击数：2132 更新时间：2021-5-13 11:29:24一、目的植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。

它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。

还原糖还能形成其他物质如有机酸等。

此外，水果蔬菜中糖量的多少，也是坚定其品质的重要指标。

还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉蔗糖等，经水解也生成还原糖。

通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，练习比色定糖法的基本操作，热悉分光光度计的使用方法。

二、原理各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用溶解度不同，可以植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。

在碱性条件下，还原糖与 3 ， 5 一二硝基水杨酸共热， 3 ， 5 一二硝基水杨酸被还原为 3-氨基 -5- 硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。

一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系， 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。

三、仪器、试剂和材料1 .仪器（ 1 ）刻度试管： 25 ml X 11（ 2 ）离心管或玻璃漏斗 X2（ 3 ）烧杯： 1OOml X 1（ 4 ）三角瓶： 100m1 X 1（ 5 ）容量瓶： 100ml X 3（ 6 ）刻度吸管： 1 ml X 1 ， 2m1 X 4, 10ml X 1（ 7 ）恒温水浴（ 8 ）沸水浴（ 9 ）离心机（过滤法不用此设备）（ 10 ）电子顶载天平（ 11 ）分光光度计2 .试剂（ 1 ） 1 mg/ ml 葡萄糖标准液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在8 0 ℃ 烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml 的容量瓶中，以馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖3,5-二硝基水杨酸比色法----标准曲线的制作 1.实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖10257 RP麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

2.实验材料、主要仪器和试剂2.1实验材料主要用到这些实验材料：红曲黄色素发酵液、钠虑膜浓缩后红曲黄色素液、旋转蒸发后红曲黄色素液。

2.2主要仪器本实验用到的实验仪器有：1) 具塞玻璃刻度比色管：25mL×19； 2) 烧杯：100mL×4； 3) 三角瓶：100mL×1；4) 容量瓶：100mL×3，50mL×3； 5) 刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1； 6)沸水浴； 7) 冰浴； 8) 扭力天平；9) UV―2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；2.3实验试剂1) 1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。

2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。

3,5－二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖
一．原理
3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，再一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。

次法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰较少，是一种很好的糖定量测定方法。

二．试剂
1. 3,5－二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)
甲液－溶解6.9克结晶酚（苯酚）于15.2毫升10％氢氧化钠中，并稀释至69毫升，再此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。

乙液－称取255克酒石酸甲钠，加到300毫升10％氢氧化钠中，再加入880毫升1％3,5－二硝基水杨酸溶液。

将甲液和乙液相混合即得黄色试剂，保存于棕色试剂瓶中，在室温下放置7－10天后使用。

2.0.1％葡萄糖标准液
准确称取100毫克分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升，保存于冰箱备用。

三.制作标准曲线
取9支大试管，分别按表一顺序加入各种试剂。

表一
将上述各管溶液混后，在紫外可见分光光度计上用绿色滤光片(520nm) 进行比色测定，用空白管溶液调零，记录光密度值。

以光密度值为横坐标，以葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

四.定糖
根据所取样品的个数来确定所需的试管数，在这里以7支试管为例，分别按表二顺序来加入各种试剂。

将各管混匀后，按制作标准曲线时的同样方法的操作，测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出还原糖含量。

还原糖%= (还原糖毫克数⨯样品稀释倍数)/培养基中总含糖量⨯100
表二。