土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)

【实验目的】1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法2、巩固使用分光光度计【实验材料】1、3、5—二硝基水杨酸显色液；2、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；3、标准葡萄糖溶液（1mg/mL）。

【实验步骤】1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,同样定容至25ml。

在550nm 处比色。

以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线（见表一）。

2、空白管的测定：取1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。

其它操作同样品管。

3、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液，冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25毫升，混匀，550nm测OD值（见表二）。

实验结果：见表一、表二：表一标准曲线的测定表二样品的测定图一：标准葡萄糖光吸收曲线结果分析：拟合所得的标准曲线为：Y=7.439×10-4X-0.00243。

拟合度为0.99917。

由样品的A值，可得三份溶液的葡萄糖含量分别为：652.5ug，648.5ug，653.9ug。

所以平均含量：651.6ug。

纤维素酶活力单位=651.6/0.01×30=2172 ug/mg×min【思考与讨论】1、在测定时为使各样品和空白管处理一致，应同时加入试剂，同时放入水浴中，同时取出水浴，以使反应得进行程度一致。

2、在测溶液的OD值之前，应将溶液摇匀，摇匀的方法是用保鲜膜蒙住试管口，然后来回震荡试管。

检测纤维素‎酶酶活力—滤纸酶活力‎(F PA)滤纸酶活力‎代表了纤维‎素酶的三种‎酶组分协同‎作用后的总‎酶活。

采用3，5一二硝基‎水杨酸法测‎定酶活：(简称DNS‎法)1、原理：纤维素经纤‎维素酶水解‎后生成还原‎糖，还原糖能将‎3，5一二硝基‎水杨酸中硝‎基还原成氨‎基，溶液变为橙‎色的氨基化‎合物，即：3一氨基一‎5二硝基水‎杨酸，在一定的还‎原糖浓度范‎围内，橙色的深度‎与还原糖的‎浓度成正比‎，据此可以推‎算出纤维素‎酶的活力。

2、采用的滤纸‎酶活单位定‎义：滤纸酶活反‎映了纤维素‎酶的3种水‎解酶，即内切型葡‎聚糖酶、外切型葡聚‎糖酶和β葡‎聚糖苷酶组‎成的诱导复‎合酶系的协‎同水解纤维‎素能力。

是该菌株整‎个纤维素酶‎系的酶活力‎水平的综合‎体现。

代表了纤维‎素酶的三种‎酶组分协同‎作用后的总‎酶活。

在此滤纸酶‎活单位定义‎为：以滤纸为底‎物，在一定反应‎条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应‎中，1ml纤维‎素酶液1m‎i n催化纤‎维素生成l‎u g葡萄糖‎为1个滤纸‎酶活单位，以U表示。

3、滤纸酶活力‎(F PA)的测定：①取0．5ml适当‎稀释的酶液‎，加入PH值‎为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲‎液l ml或‎柠檬酸-柠檬酸钠缓‎冲液lml‎；②再加入50‎±0.5mg滤纸‎(1cmx6‎c m)一条，于50℃保温酶解反‎应1小时，(先预热5分‎钟)；③加入DNS‎显色液3m‎l(标准曲线用‎量是1.5ml)，放入已沸腾‎的水中沸水‎浴l Omi‎n，流水冷却后‎在540n‎m下测吸光‎度；④同时用10‎0℃煮沸lOm‎i n后失活‎的酶液做对‎照，扣除本底；⑤根据吸光度‎从葡萄糖标‎准曲线中查‎出相应的葡‎萄糖含量，根据生成的‎葡萄糖克数‎计算出酶活‎值。

滤纸酶活按‎下面公式计‎算：X=（WxNxl‎O OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶‎活力，单位U／mL。

实验纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）一、实验目的掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。

二、实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。

三、主要仪器与试剂(一)实验仪器1. 25mL比色管2. 722型分光光度计3. 滴管4.水浴锅5.移液枪6.电炉(二)、试剂1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10.0 g 3,5-二硝基水杨酸，溶入200mL蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水至500mL，升温溶解后，加入重蒸苯酚2.0g，无水亚硫酸钠0.50g。

加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL。

存于棕色瓶中，放置一周后使用。

2. 0.1mol/L pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。

使用前摇匀。

4. 葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg，溶解后定容至100mL，此溶液含葡萄糖1.00mg/mL。

5. 纤维素酶液：将0.05g酶溶解定容至50 mL，从中取出1.0mL再定容至100mL，待检测用。

（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）四、实验步骤1.标准曲线的绘制：分别吸取0.0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00m L 葡萄糖标准液于6支25mL比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL，在沸水浴中煮沸显色10min，冷却，加蒸馏水21mL，摇匀。

以空白管调零，在550nm处比色。

以光密度为纵坐标，以葡萄糖μg数为横坐标，绘出标准曲线。

序号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标液0.0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.03,5-二硝基水杨酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 实验操作沸水浴加热10min，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定吸光度A550nm0.02.空白管的测定：在2支25mL试管中各加入1.0mL酶液，沸水浴5min，冷却后加3.0mL 0.5%CMC-Na，与样品管同时放入50℃水浴30min。

纤维素酶：酶活测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法；540nm比色；1 试剂配制：（1）1%羟甲基纤维素溶液（2）PH5.5 磷酸盐酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g磷酸氢二钠溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

（3）甲苯（4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。

（5）葡萄糖标准溶液（1ml标准液含0.2—0.8mg葡萄糖）。

标准曲线绘制：分别取不同浓度标准葡萄糖溶液1ml移于25ml容量瓶中，加3ml二硝基水杨酸溶液。

将试管放在沸腾水浴上5min，然后迅速冷却3min。

定容，15min后在分光光度计上于波长540nm处比色测定。

以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2 操作步骤称取10g土壤置于50ml三角瓶中，加20ml 1%羟甲基纤维素溶液、5ml PH5.5磷酸缓冲液及1.5ml 甲苯，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。

培养结束后，过滤并定容25ml。

取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。

每一试验处理均应设置以3ml水代替基质的对照，为检验试剂纯度应设无土壤的对照组。

纤维素酶活性，以72h，10g土壤生成葡萄糖毫克数表示。

蔗糖酶：风干土酶活测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法；508nm比色；1 试剂配制：（1）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。

2）PH5.5 磷酸盐酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）0.5ml 加1/15M磷酸氢二钾（9.078g磷酸氢二钾溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

（3）8%蔗糖溶液。

检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。

采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。

2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。

是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。

代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。

在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。

3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。

滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。

W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。

N：为酶液稀释总倍数。

T：为反应时间。

M：为样品的体积。

4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。

生物化学实验报告题目：纤维素酶活力的测定-----3、5—二硝基水杨酸法姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科3班同组者：张刚刚时间：2011/4/22一、【实验目的】学习和掌握3、5—二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。

二、【试验原理】纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物,在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。

酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。

测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。

酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。

在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。

因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

实验中定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为1个酶活力单位。

N×OD值对应的葡萄糖量纤维素酶活力单位＝——————————————30×LN——酶液的稀释倍数30——糖化所用时间L——反应酶液毫升数三、【试验器材】比色管10支，5ml移液管，移液枪，500ml大烧杯，水浴锅，电炉，搅拌振荡器，722 型或其他型号的可见分光光度计。

四、【实验试剂】1．酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测（用PH4.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液配制）。

2．0.1mol/L PH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3．3、5—二硝基水杨酸显色液：称取10克3、5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。

纤维素酶活力测定（3,5-二硝基水杨酸法）姓名：高超年级：13级生科三班学号：201300140020同组者：樊晓航一，实验目的：1，学习掌握光度计的使用；2，学习用 3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力二，实验原理：1、3,5-二硝基水杨酸法测纤维素酶活力的原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维素二糖、葡萄糖等还原糖，能将 3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙色的氨基化合物，利用比色法测定还原物生成量来表示酶的活力。

2、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖的原理还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。

在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈橘红色，在 540nm 处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可以测定样品中还原糖的含量。

三，实验器材：器材; 比色管、水浴锅、电炉、分光光度计、容量瓶 100ml、烧杯、移液枪试剂 :1、3,5-二硝基水杨酸试剂,2、0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液，溶解后成胶装液，静置过夜，使用前摇匀。

3、酶液（10ug/ml）四，实验步骤：1 ，标准曲线的绘制：在还原糖实验中已做曲线如下：2，. 空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。

其它操作同样品管。

3. 样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml分别加入到三只比色管中标记为1，2，3，于50度水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml 显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm 测OD值4，测得的实验值如下;空白管：01号管：0.4262号管：0.4033号管：0.402五，试验结果分析：由三组平行实验结果，可用0.403带入计算得0.561mg/ml,所以在30分钟内生成的还原糖为14.022mg;酶活力计算公式为：（14.022×100）/30=46.74六，注意事项：1，在测定OD值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖浓度为0）调零，测定样品OD值时要用样品空白液调零。

土壤酶活性测定方法1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。

它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。

土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。

根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。

人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。

本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。

三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。

培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

土壤酶活性测定方法土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。

它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。

土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。

根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。

人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。

本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。

三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。

培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

土壤酶活性测定的实验步骤土壤酶的测定1．三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。

2．土样研磨精细后分袋装好。

土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5某2=29g。

一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）1．试剂配制：(1)0.3%过氧化氢溶液：①（1：10030%的H2O2和水）②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）③（1ml30%H2O2+99ml蒸馏水）(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）(3)0.1N 高锰酸钾溶液：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）2．操作步骤：2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色3．结果计算过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1NKMnO4的毫升数表示：M=（A－B）某T式中：A：空白消耗的0.1NKMnO4毫升数B：滤液消耗的0.1NKMnO4毫升数T：KMnO4滴定度的校正值备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。

此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用二、蔗糖酶（P278）滴定法1.试剂配制：(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）(2)甲苯(分析纯)(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液0.5ml磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)+9.5ml磷酸二氢钾（1/15M）磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)：23.88gNa2HPO4,，加H2O溶解，定容至100ml。