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猪G蛋白偶联受体12_Gpr12_基因克隆鉴定及其表达分析

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猪G蛋白偶联受体12（Gpr12）基因克隆

鉴定及其表达分析

张宝乐1，2，李晔2，石放雄2，徐银学2*（1．徐州医学院神经生物学教研室，江苏徐州221002；2．南京农业大学动物科学技术学院，江苏南京210095）

摘要：为研究猪G蛋白偶联受体12（Gprotein-coupledreceptor12，Gpr12）基因的序列和组织表达特征，探索Gpr12mＲNA在卵泡发育过程中的

表达规律，本研究利用克隆测序技术获取猪Gpr12基因的编码区序列，并利用生物信息学方法分析Gpr12基因序列和蛋白的潜在特征；ＲT－PCＲ技术检测Gpr12基因的组织表达模式；荧光定量PCＲ技术检测Gpr12mＲNA在猪卵泡发育过程中的表达规律。结果表明：猪Gpr12基因编码区序列长1005bp，编码蛋白含有典型的7次跨膜结构域和DＲY基序，存在多个潜在的磷酸化和糖基化修饰位点；Gpr12基因在所检测的组织和细胞中均有表达，且在脑、垂体和卵母细胞中高表达；随着卵泡的发育，Gpr12mＲNA的表达量极显著升高（P＜0.01），表明Gpr12基因可能参与了猪卵泡发育的调控过程。关键词：猪；G蛋白偶联受体12；基因克隆；表达

中图分类号：S828文献标志码：A文章编号：0529－5130（2014）12－0010－05

Molecularcloning，identificationandexpressionofGpr12geneinpigsZHANGBaole1，2，LIYe2，SHIFangxiong2，XUYinxue2*（1．DepartmentofNeurobiology，XuzhouMedicalCollege，Xuzhou221002，China；2．CollegeofAnimalScienceandTechnology，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China）

Abstract：Tostudythesequencefeature，tissueexpressionprofileandtheexpressionpatternintheprocessoffolliculardevelopmentof

porcineGprotein-coupledreceptor12（Gpr12）gene，thecompletecodingsequenceofporcineGpr12genewasclonedbyＲT－PCＲ．Bioin-formaticsmethodswereadoptedtoanalyzethesequencefeatureofGpr12geneandpredictthestructureandfunctionofGpr12protein．TheexpressionpatternsofthegeneinvarioustissuesandtheprocessoffolliculardevelopmentwereinvestigatedusingＲT－PCＲandreal-timePCＲ，respectively．TheresultsindicatedthatthecodingsequenceofGpr3genewithitslengthbeing1005bpnucleotidesencodeda330ami-noacidprotein，whichcontainedthetypicalseven-transmembranestructureofGPCＲsandDＲYmotif，includingseveralpotentialphospho-rylationandN－glycosylationsites．Gpr12genewasexpressedinallthetestedtissuesandcells，theexpressionlevelsofthisgeneinbrain，pituitaryandoocytesbeinghigherthanthatinothertissues．TheexpressionlevelofGpr12mＲNAwasup-regulatedsignificantlyduringfolli-cledevelopment（P＜0.01），suggestingthatGpr12mightbeinvolvedintheregulatoryprocessofporcinefolliculardevelopment．

Keywords：pig；Gprotein-coupledreceptor12（Gpr12）；molecularcloning；expression

G蛋白偶联受体12（Gprotein-coupledreceptor12，Gpr12）是孤儿G蛋白偶联受体超家族成员，其

序列首次从大鼠的脑垂体cDNA文库中被克隆［1］，起

初命名为候选的GPCＲ或者GPCＲ01［2］。随后的研究

发现，Gpr12基因不仅分布于脑垂体，在大脑、卵巢

收稿日期：2014－06－10基金项目：国家高技术研究发展计划项目（863计划）（批准号：2006AA10Z136）、江苏省研究生创新计划（CXLX11－0701）和徐州

医学院优秀人才基金（53591307）资助的课题作者简介：张宝乐（1983－），男，讲师，博士，

主要从事动物

分子遗传学、神经生物学方面的研究*通信作者：徐银学，教授，研究方向为动物分子遗传与现代育

种，E-mail：xuyinxue@njau.edu.cn

和睾丸组织中也有大量的表达［2－3］，并且能够在PC等细胞系中通过升高胞内的cAMP水平，促进神经元轴突的生长［4－5］。最近的研究发现，Gpr12

受体属于

Gpr3亚家族成员，能够协同Gpr3受体通过激活下游

Gs蛋白介导的信号通路，维持小鼠和爪蟾卵母细胞

减数分裂的前期阻滞［3，6］，表明Gpr12受体介导的信

号通路参与了卵泡发育的调控过程。目前，大鼠、小鼠、人和牛等哺乳动物的Gpr12基因已相继被克隆和鉴定，而猪Gpr12基因序列尚未见报道。为了克隆鉴定猪Gpr12基因，我们利用电子克隆和ＲT－PCＲ技术，获得了猪Gpr12基因的编码区序列，并利用生物信息学方法对其结构及功能进行了系统的分析；随后，利用ＲT－PCＲ和荧光定量PCＲ技

·01·AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2014Vol.46No.12术检测了Gpr12mＲNA在猪的各组织及大中小卵泡中

的表达情况，为进一步探明猪Gpr12基因的潜在功能提供了新的线索。1材料与方法1.1样品采集6月龄杜长大三元商品母猪（n=6，公母各半）由无锡宜兴农牧有限公司提供。屠宰后，立即采集大脑、卵巢等12种组织，置于液氮中，用于组织表达谱分析。另外，从南京市哈慈天环食品有限公司下属屠宰场采集猪卵巢，用于分离大、中、小卵泡及卵母细胞的体外培养，培养方法参照本课题组前期报道［7］。根据表面直径，将卵泡分为直径小于2mm的小卵泡、3～5mm的中卵泡和大于6mm的大卵泡。1.2ＲNA提取和反转录采用TＲIzol（Invitrogen公司）一步法从各组织和卵母细胞中提取总ＲNA，操作过程按照说明书进行，随后利用DNaseI（TaKaＲa公司）处理以除去其中的痕量基因组DNA。紫外分光光度仪测定总ＲNA浓度及纯度。以2μg总ＲNA为模板用M－MLV反转录酶（Promega公司）和Oligo（dT）18进行反转录合成cDNA第一链。1.3引物设计以人Gpr12基因cDNA序列（GenBank序列号：NM_005288.3）为电子探针，借助NCBI网站的Blast程序在猪的EST－other和SusscrofaHTGS数据库中分别搜索猪的同源序列，发现1条与人Gpr12同源性大于90%的猪HTGS序列（CU468407.2），但没有获得相似的EST序列。利用人Gpr12和猪HTGS序列的比对结果，根据其保守序列利用PrimerPremier5.0软件设计1对基因特异性引物（Gpr12OＲF－F，Gpr12OＲF－Ｒ），用于扩增猪Gpr12基因的编码区。根据扩增出的猪Gpr12基因编码区序列和GAPDH基因mＲNA序列（GenBank序列号：AF017079），设计定量PCＲ检测引物，引物具体信息见表1，由Invitro-gen公司合成。表1引物信息1.4克隆测序以三元商品猪卵巢组织cDNA为模板，扩增Gpr12基因的完整编码区序列。PCＲ反应体系：10μL2×TaqPCＲMasterMix（TaKaＲa公司），0.5μL上、下游引物（10μmol/L），1μLcDNA模板，加双蒸水至终体积20μL。PCＲ反应条件：95℃5min；94℃30s，56.3℃30s，72℃80s，32个循

环；72℃10min。PCＲ产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收，并亚克隆于pMD19－T载体中（TaKaＲa公司）转化DH5α感受态细胞；挑取阳性

克隆，用质粒提取试剂盒（Axygen）提取质粒，经PCＲ鉴定后，送Invitrogen公司测序。1.5生物信息学分析

利用NCBI中的OＲFFinder（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/projects/gorf/）对获得的猪Gpr12基因序

列进行阅读框架的识别；Blast程序（http：//blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi）在猪基因组数据库中对Gpr12基因进行初步的染色体定位，并选用6种哺乳动物Gpr12的核酸序列进行同源性分析，其中包括牛（BosTaurus：NM001206330.1）、黑猩猩（Pantroglodytes：XM001157503.2）、人（Homosapiens：NM005288.3）、犬（Canislupusfamiliaris：XM543160.3）、小鼠（Musmusculus：NM008151.3）、大鼠（Ｒattusnorvegicus：NM030831.1）；采用ExPASy－ProtParam（http：//www．

expasy．ch/tools/protparam．html）预测猪Gpr12氨基酸

构成及性质；利用SignalP4.0［8］（http：//genome．cbs．

dtu．dk/services/SignalP）预测猪Gpr12蛋白的信号肽；

PSOＲTIIprogram［9］（http：//psort．ims．u-tokyo．ac．jp/

form2．html）预测猪Gpr12

蛋白的亚细胞定位；CBSPre

－dictionServers（NetPhos2.0和NetNGlyc1.0Server；http：//www．cbs．dtu．dk/services）预测猪Gpr12蛋白潜

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猪胸膜肺炎放线杆菌ftsW 基因的克隆和分析

猪胸膜肺炎放线杆菌ftsW 基因的克隆和分析

2018年第9期猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度传染性疾病。

该病急性型死亡率可达100%,常表现为急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎。

近些年来，随着养猪集约化程度提高，猪群引种频繁，导致该病的发病情况更加复杂，常呈混合感染，包括多种致病细菌、病毒性和寄生虫病原在内的混合感染，混合感染使该病及其它猪病的防制难度增大，经济损失巨大。

Pattison 等1957年首次报道了该病。

迄今为止，已证实本病世界范围内有广泛流行，包括欧洲、美洲、非洲、澳洲、东南亚等地区。

流行的主要血清型有血清1、2、5、7型，其中血清2型主要流行于欧洲国家，其他血清型主要在北美地区流行。

1987年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次确诊猪传染性胸膜肺炎临床病例，证实了我国存在猪传染性胸膜肺炎。

目前我国二十多个省、市、自治区相继分离出猪传染性胸膜肺炎细菌，研究表明，我国流行的主要是血清1、3、4、5、7型，主要以血清7型为主，其次为血清2、4、5、10型。

猪传染性胸膜肺炎的防治以药物为主，免疫预防主要采用灭活苗，但免疫保护谱窄，不能产生交叉免疫保护。

亚单位疫苗主要集中在其毒力因子，但其最大的缺点是免疫保护效果差，临床应用意义不大，因此有必要寻找新的疫苗候选分子。

同时由于长期用药抗药性产生的可能性。

因此筛选一些新的疫苗候选分子及药物靶点非常重要,为此进行了本研究。

1材料和方法1.1.1菌种和培养基猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型来自湖南农业大学实验室保存。

胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）从青岛日水生物技术有限公司购买。

无支原体超级新生牛血清从杭州四季青生物工程材料有限公司购买。

NAD 氧化型辅酶Ⅰ从北京鼎国生物技术有限公司购买。

1.1.2主要试剂PCR 反应用试剂（2×Taq PCR Master Mix ）、DNA 标准分子量（D2000Maker）从北京天根生化科技有限公司购买。

1.2.1猪胸膜肺炎放线杆菌ftsW 基因的扩增根据Gen-Bank 中已收录的App 基因组序列中的ftsW 基因序列,应用软件进行引物设计，设计ftsW 外引物一对。

大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析

大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析

大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析张晋玉;徐新娟;晁毛妮;张晓红;吴向远;高际涛;黄中文【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2022(37)3【摘要】锌指蛋白是真核生物中被广泛研究的转录因子,在植物生长发育和逆境应答中发挥重要作用。

为了揭示大豆锌指蛋白基因功能,从商豆1201中克隆获得GmZAT12基因的CDS全长序列,并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。

通过烟草表皮注射系统检测GmZAT12蛋白的亚细胞定位情况,采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术对GmZAT12基因在大豆不同组织和非生物胁迫中的表达模式进行分析。

结果表明,GmZAT12全长516 bp,共编码171个氨基酸,分子质量为19.26428 ku,理论等电点(pI)为9.02;主要构成元件为无规则卷曲和α螺旋;含有20个磷酸化位点,其中以丝氨酸磷酸化位点为主。

序列分析结果表明,GmZAT12蛋白含有2个保守的C2H2锌指结构域;亚细胞定位结果显示,GmZAT12蛋白定位于细胞核。

qRT-PCR表达分析结果显示,GmZAT12基因在大豆根、叶片和种子中表达量较高,在花和茎中表达量较低;GmZAT12基因受到高温、低温、NaCl和ABA诱导表达,推测该基因可能参与大豆非生物胁迫应答。

【总页数】7页(P1-7)【作者】张晋玉;徐新娟;晁毛妮;张晓红;吴向远;高际涛;黄中文【作者单位】河南科技学院【正文语种】中文【中图分类】S565.1;Q78【相关文献】1.大豆GmVE2基因克隆及其在大豆籽粒维生素E动态积累中的表达分析2.国家自然基金项目《大豆暗诱导下光周期相关基因的差异表达、克隆与基因功能分析》通过验收3.大豆GmFtsH2基因的克隆及表达分析4.大豆GmSg-5基因的克隆、序列分析及表达分析5.大豆GmCYP85A2基因克隆与表达特性分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

Overlap-PCR克隆秦川⽜HCRTR1基因及其在⼤肠杆菌中的表达分析农业⽣物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(4):568~572* 基⾦项⽬：国家⾼技术研究与发展计划（863）项⽬（No.2006AA10Z197）、国家⾃然科学基⾦（No.30771544）、国家⽀撑计划（No. 2006BAD01A10-5）和西北农林科技⼤学拔尖⼈⽀持计划（No.01140101）基⾦资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授，博⼠⽣导师，主要从事⽣物技术与家畜育种研究。

Email ：〈chenhong1212@/doc/93669af8fab069dc5022010f.html 〉 . 收稿⽇期：2007-09-20 接受⽇期： 2007-11-09 ·研究论⽂· Overlap-PCR 克隆秦川⽜基因及其在⼤肠杆菌中的表达 *张丽 1， 2 ，张良志 1 ，张爱玲 1， 4 ，陈宏 1， 3 **，张春雷 1， 3，张琴 1（1.西北农林科技⼤学动物科技学院，陕西省农业分⼦⽣物学重点实验室，杨凌 712100； 2.⼴东海洋⼤学农学院，湛江524025； 3.徐州师范⼤学细胞与分⼦⽣物学研究所，徐州221116； 4.贵州⼤学⽣命科学学院，贵阳550025）摘要：通过 Overlap-PCR ⽅法克隆了秦川⽜（）的增⾷欲素受体 1 （）基因编码区全长，获得 1278bp 编码区全长序列(GenBank 登录号:DQ874350)，将其克隆⾄ pMD-18T 载体上，经测序表明获得的cDNA 序列与GenBank 公布的序列同源性均为98%。

阳性质粒经 H ⽟和d 芋双酶切后，将⽬的⽚段定向克隆到pET32a （+）表达载体上，转化 Bl21(DE3) 感受态⼤肠杆菌（），经鉴定正确后，⽤ IPTG 诱导⽬的蛋⽩的表达。

猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酶1(SRPK1)克隆表达及功能初步分析

猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酶1(SRPK1)克隆表达及功能初步分析

猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酶1(SRPK1)克隆表达及功能初步分析俄广鑫;刘娣;张冬杰;杨秀琴;崔羽;祝继原;杨少成;王嘉博;谢宇彤【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2010(041)011【摘要】本研究旨在阐明猪SRPK1基因的分子特点和表达谱.以大白猪为研究对象,利用RT-PCR技术克隆SRPK1基因CDS区域,同时利用反向PCR(inverse PCR,I-PCR)技术得到猪部分SRPK1的5'UTR序列;利用生物信息学方法分析SRPK1基因核苷酸序列及编码蛋白序列的结构特点;利用荧光定量PCR(real-time PCR)检测SRPK1在1和30日龄大白猪及杜洛克的心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、小肠、大肠、脑的表达情况;构建猪骨骼肌损伤模型,研究在骨骼肌发育过程中SRPK1基因的表达特性.结果,将克隆片段拼接得到长2 499 bp的大白猪SRPK1基因序列,包含了1 968 bp完整CDS区域,分析表明其编码含656个氨基酸的蛋白质;包括2个P_Kc结构域,猪SRPK1蛋白序列与人和黑猩猩的相似性较高.通过生物信息学方法预测所得5'UTR含有多个转录结合位点:HSF1、HSF2、Ik-1、IK-2、SRY、SPI MyoD、USF、FAT、p300,CP2、RREB-1、E2F和AP-1.利用荧光定量PCR研究发现,表达结果显示猪该基因表达具有组织和种间特异性,主要都是在胃、大肠和小肠中表达.SR-PK1基因在整个损伤修复过程中的表达反复出现升高和降低.5'UTR处有多个和肌肉生长相关蛋白的转录结合位点,主要在消化系统组织表达,在骨骼肌修复中表达上调,推测其可能与骨骼肌细胞发育或其他肌肉生长相关因子的表达有关.【总页数】8页(P1379-1386)【作者】俄广鑫;刘娣;张冬杰;杨秀琴;崔羽;祝继原;杨少成;王嘉博;谢宇彤【作者单位】东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨,150030;黑龙江省农业科学院畜牧中心,哈尔滨,150086;黑龙江省农业科学院畜牧中心,哈尔滨,150086;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨,150030;海南大学农学院,海口,570228;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨,150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨,150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨,150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S828;Q527【相关文献】1.光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin-FA72的克隆、表达及功能验证[J], 赵钰;刘忠渊2.两个大豆类受体蛋白激酶基因的克隆及其结构和功能的初步分析 [J], 宋爽;赵宏巍;曹俊然;方琳;王勇;朱亮基;张韧;王宁宁3.奶山羊过氧化物酶体增殖物激活受体基因(PPARγ)的克隆、表达及功能初步分析[J], 石恒波;罗军;姚大为;孙雨婷;李君;朱江江;史怀平4.小麦类受体蛋白激酶基因TaPK3A的克隆与抗纹枯病功能初步分析 [J], 苏强;荣玮;张增艳5.盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化 [J], 陶晓迎;柴晓杰;薛飞;李秀娟;丛玉婷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。