HPLC 法测定安神温胆丸中五味子醇甲的含量

・实验研究・H P LC法测定安神温胆丸中五味子醇甲的含量王应斌1,穆仙丽2[摘要]目的建立安神温胆丸中五味子醇甲的含量测定方法。

方法反相高效液相色谱法,Alltima C２18柱,流动相为甲醇２水(60∶40),检测波长为250nm。

结果五味子醇甲在0.01589～0.38140μg范围内呈良好的线性关系,r=0.9999,平均回收率为102.05%,RSD为1.80%(n=6)。

结论该方法简便、快捷、重复性好、能够有效地控制安神温胆丸的内在质量。

[关键词]反相高效液相色谱法;安神温胆丸;五味子;五味子醇甲;含量测定[中图分类号]R285 [文献标识码] A [文章编号]1726２7587(2010)01２0027２04安神温胆丸收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第四册[1],由制半夏、陈皮、竹茹、酸枣仁(炒)、枳实、远志(制)、五味子、人参、熟地黄、茯苓、朱砂、甘草、大枣等十三味药材组成的中成药复方制剂,具有和胃化痰,安神定志之功效,临床上用于治疗心胆虚怯、触事易惊、心悸不安、虚烦不寐。

据文献报道[2],五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz)Balii.的干燥成熟果实。

其主要有效活性成分为挥发油、木质素、有机酸等。

其中木质素中的五味子醇甲(五味子素)schizan２drin、α２,β２,δ２,ε２五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素为本品的有效成分。

原质量标准无含量测定监控指标,参照《中国药典》2005年版一部“五味子”项下[含量测定]方法[3],采用高效液相色谱法建立含量测定方法。

经方法学考察和对三批样品的含量测定结果表明,本法操作简便,重复性好,检测方法具有灵敏度高、分离效能好、准确等优点,结果满意。

1仪器与试剂1１1 仪器日本岛津LC２2010A高效液相色谱仪、日本岛津UV２2450紫外２可见分光光度仪。

1１2 试剂甲醇为色谱纯,水为纯化水,其他试剂均为分析纯。

1１3 对照品五味子醇甲对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号:110857２200507(供含量测定用)。

作者单位:1012000 内蒙古,乌兰察布市中心医院2012000 内蒙古,福瑞中蒙药科技股份有限公司1１4 样品由吉林金泉山药业集团股份有限公司提供:1批小蜜丸(批号:20070301);2批大蜜丸(批号:20070101、20070103)。

2耐用性考察2１1 色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;Alltima C２18,250×4１6mm,5μl,以甲醇２水(60∶40)为流动相;检测波长为250nm;流速0１8ml/min;进样量10μl;柱温35℃。

吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,进样,测定。

结果供试品色谱在与对照品色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰,样品中五味子醇甲峰完全基线分离,保留时间17min左右,五味子醇甲的理论板数为12000。

2１2 检测波长的选择取五味子醇甲对照品溶液,在200～400nm波长范围内进行光谱扫描。

结果五味子醇甲在250１8nm波长处有最大吸收,参照《中国药典》2005版一部相关种项下规定确定250nm 为本方法的测定波长,见图1。

2１3 流动相的选择参照《中国药典》2005版一部“五味子”[含量测定]项下,以甲醇２水为流动相,分别对(65∶35)、(62∶38)、(60∶40)不同比例进行试验,试验结果表明,以甲醇２水(60∶40)为流动相,出峰时间恰当,峰形理想,分离度较好。

2１4流速的选择分别对流速1１0ml/min、0１9ml/min、0１8ml/min进行比对试验,试验结果表明调低流速至0１8ml/min时,峰形理想,理论塔板数高。

2１5 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。

3溶液的制备3１1 对照品溶液的制备取五味子醇甲对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含15μg的溶液,即得。

3１2 供试品溶液的制备取重量差异项下的本品适量,剪碎,取大蜜丸约2１4g或小蜜丸2１0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理(功率250W,频率40kHz)30min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

3１3 阴性对照溶液的制备取除五味子外的各味药材,按处方量的1/10量,同样品同工艺制备阴性样品,取阴性样品同供试品溶液的制备,即得。

4方法学考察4１1 提取溶剂的选择以甲醇、石油醚为提取溶剂,按拟定方法分别制备供试品溶液,进样,测定。

试验结果表明,采用甲醇作提取溶剂,超声处理提取率较高。

4１2 提取时间的选择取供试品,分别超声处理0１5h、1h、2h、3h制备供试品溶液,进样,测定。

试验结果表明,超声提取0１5h与1h,含量基本无大的变化,超声提取2h、3h后,提取率降低。

4１3 专属性考察取阴性空白样品,同供试品溶液的制备阴性供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl,注入液相色谱仪。

试验结果表明,阴性供试品溶液在与对照品色谱相同保留时间处无对应峰,表明该方法其他组分对五味子醇甲无干扰,见图2～4。

图1五味子醇甲的光谱图图2 供试品的HPLC图谱图3 对照品的HPLC图谱图4 阴性样品的HPLC图谱4１4 线性范围的考察精密称取五味子醇甲对照品3１179mg,置200ml量瓶中,加甲醇至刻度(制成每1ml含15１895μg的溶液),分别精密吸取1、2、4、8、16、24μl注入液相色谱仪,测定,以进样量为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。

试验结果表明五味子醇甲在0１01589～0１38140μg范围内,呈良好线性关系,回归方程为: Y=2E+06X-1539１7,r=0１9999。

进样量及相对应峰面积积分值0１01589、0１03179、0１06358、0１12716、0１25432和0１38140;27531、71421、131159、261125、530941、795889。

4１5精密度试验取样品(大蜜丸,批号20070101),按拟定方法制备供试品溶液,重复注入液相色谱仪6次,试验结果表明精密度良好。

4１6稳定性试验取样品(大蜜丸,批号:20070101),按拟定方法制备供试品溶液,分别于不同时间注入液相色谱仪,试验结果表明样品中五味子醇甲在48h内基本稳定。

4１7 重复性试验取同一批号样品(小蜜丸,批号:20070301),平行制备6份供试品溶液,按拟定色谱条件,测定。

结果见表1,表明本法重复性尚可。

4１8 准确度试验精密称取已知含量的供试品(小蜜丸,批号:20070301,含量为0１194mg/g)6份,每份约1１0g,置具塞锥形瓶中,分别精密加入对照品溶液(2１221mg/100ml)10ml,再精密加入甲醇15ml,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40kHz)30min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

按拟定色谱条件测定,计算回收率(%)。

结果见表2。

表1 重复性试验序号取样量(g)峰面积积分值含量(mg/g)平均含量(mg/g)R SD(%)12１16533568420１19822１11823475370１19732１131********１1960１1941１83 42１14993513570１19652１00063164920１19062１00113163580１190表2 加样回收试验结果序号取样量(g)含量(mg)对照品加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%) 11１11580１21640１22210１43799１3221１10220１21380１22210１441102１231１09130１21170１22210１443104１14102１051１80 41１12070１21740１22210１448103１8251１18310１22950１22210１453100１6361１14050１22120１22210１448102１11试验结果表明该方法准确度较高,测定结果真实、可靠。

4１9 样品含量测定对吉林金泉山药业集团股份有限公司生产的三批样品,按拟定的方法进行含量测定。

结果见表3。

表3 样品中五味子醇甲含量测定结果批号峰面积含量平均含量200703013863810１210(mg/g)0１209(mg/g) (小蜜丸)384818200703013803740１207(mg/g)(小蜜丸)378508200701014360421１933(mg/丸)(大蜜丸)437554200701014392651１926(mg/丸)(大蜜丸)434486200701034269791１902(mg/丸)1１920(mg/丸) (大蜜丸)420955200701034214561１895(mg/丸)(大蜜丸)4185814１10检测限的确定中国药典2005年版(一部)五味子项下规定五味子中含五味子醇甲的最低限度为0１4%,根据处方量及制法,按规定的药材含量最低限度百分之百提取率计算,考虑到生产中各种因素的影响,可将最低限量的80%定为检测限。

以直观法对本试验进行分析应暂定为本品含五味子以五味子醇甲(C24H32O7)计,小蜜丸含量不得少于0１15 mg/g,大蜜丸每丸不得少于1１50mg/g。

[参考文献]1中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准:中药成方制剂(四册),1978,76.2吕武清.中成药中中药材的薄层色谱鉴别.北京:人民卫生出版社,1978,128.3中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:化学工业出版社,2005,44.4肖望书.HPLC测定刺五加脑灵液中异嗪皮和五味子醇甲的含量.中成药,2009,31(5):737.(收稿日期:2010２01２05)(本文编辑:丁平)当归多糖对气道上皮细胞损伤后修复的影响王群[摘要]目的研究当归多糖对气道上皮细胞损伤后修复的影响,并初步研究其具体的分子机制。

方法采用气道上皮细胞划痕损伤模型。

结果发现当归多糖在5～50ng/ml的浓度范围内对损伤气道上皮细胞有显著的促修复作用,且该作用随着浓度的递增而逐步增强,100ng/ml的当归多糖则对损伤气道上皮细胞的修复有显著抑制作用。

当归多糖可显著促进气道上皮细胞EGF的合成,且损伤气道上皮细胞上清液EGF含量与细胞损伤面积显著负相关(相关系数γ=-0１994,P<0１05)。

结论本研究提示当归多糖对损伤气道上皮细胞的促修复作用可能通过其促进气道上皮细胞EGF的合成有关。