实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含
量
一、实验目的
1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。
2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。
3.了解流动相的选择依据及配制方法。
4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。
二、实验原理
高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。
三、实验内容
（一）实验仪器与材料
1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。
2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。
（二）实验内容
1、色谱操作条件的制定：
色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）；
流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80）
流速：1mL/min
检测波长：277nm
柱温：35℃
进样量：20μL
2、标准溶液配制
精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。
3、标准曲线的建立
（1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
液置于1.5mL的EP管中并标号，各进样20μL检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。
（2）线性要求：色谱峰分离度大于1.5，浓度点n＝5。用浓度c对峰面积A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.999，方程的截距应近于零。
4. 样品溶液的配制
精密称取甲硝唑原料药10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，摇匀，再从中取出0.7mL定容至10mL，即得甲硝唑样品溶液。
5.甲硝唑样品含量测定
用注射器吸取已配制好的甲硝唑样品溶液适量，过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置于1.5mL的EP管中并标号，再从中吸取20μL注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法在277nm 波长处测定溶液中甲硝唑峰面积，最后通过标准曲线计算样品中甲硝唑的含量。
四、实验结果
1.标准曲线方程及绘制。
2.甲硝唑样品含量。
