万古霉素骨水泥缓释药物观察及检测方法建立

中国实验诊断学２０１７年７月　第２１卷第７期　研究。　因为皮肤移植和心脏移植抗原提呈的途径不尽　相同，免疫反应的机理不同，可能对移植物的排斥反　应、免疫耐受的诱导造成影响，而本研究中皮肤心脏　联合移植模型的建立，为移植免疫学的实验研究建　立了一个全新的模型，为研究者提供了一个新的选　择，且技术难度不大，成功率高，移植物排斥反应监　测简便，结果确切，值得推广。　作者简介：胡钰，医学博士，主治医师。　参考文献：　ｒ１］Ｃｏｒｒｙ　ＲＪ，Ｗｉｎｎ　ＨＪ，Ｒｕｓｓｅｌ　ＰＳ．Ｐｒｉｍａｒｉｌｙ　ｖａｓｅｕｌａｒｉｚｅｄ　ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ　ｏｆ　ｈｅａｒｔｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｈ一２Ｄ．Ｈ一２Ｋ，ａｎｄ　ｎｏｎ－Ｈ一２　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｉｎ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ０ｎ，１９７３，１６（４）：３４３．　［２］Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ　ＲＥ，Ｍｅｄａｗａｒ　ＰＢ．Ｔｈｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｏｆ　Ｆｒｅｅ　Ｓｋｉｎ　Ｇｒａｆｔ一　文章编号：１００７—４２８７（２０１７）０７—１２５９—０２　１２５９一　ｉｎｇ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ，１９５１，２８：３８５．　［３］樊拥军，张凤蕴，张飚，等．一种简单的小鼠皮肤移植方法Ｉ－Ｊ］．　哈尔滨医科大学学报，２０００。３４（５）：３３２．　［４］成功，陈明，孙则禹，等．建立小鼠皮肤移植排斥模型稳定获　得记忆Ｔ细胞［Ｊ］．中国比较医学杂志，２００８，１８（４）：３２．　［５］Ｃｈｅｎ　ＨＡ．Ｎｅｗ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｏｆ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ　ｈｅａｒｔ　ｔｒａｎｓｐｌａｎ—　ｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９１，５２（６）：１０９９．　［６］Ｄｅｍｉｒ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　Ｙ，Ｍｅｔｚ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｒｄｉａｃ　ａｌｌｏｇｒａｆｔ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒｒＪ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎ—　ｔａｔｉｏｎ，２００３，７６（１）：２４４．　［７］ｕ１ｕｓａｌ　ＢＧ，Ｕｌｕｓａｌ　ＡＥ，Ｗｅｉ　ＦＣ，ｅｔ　ａ１．Ａｌｌｏｇｒａｆｔ　ｍａｓｓ　ａｓ　ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｋｉｎ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　ｏｕｔｃｏｍｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ，２０１０，１６１（２）：３２１．　（收稿日期：２０１７—０３—２Ｏ）　万古霉素骨水泥缓释药物观察及检测方法建立　李晨光　，赵虹“，季红　（１．延边大学临床医学２０１３级，吉林延吉１３０００￣；２．吉林大学中日联谊医院，吉林长春１３００３３）　，　万古霉素（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）为糖肽类抗生素，临床　上用于严重革兰氏阳性菌、耐甲氧西林的金葡菌　（ＭＲＳＡ）、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌（ＭＲＳＥ）所　致的感染。１９７０年，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ等发现抗生素掺入骨　水泥中可以形成抗生素缓释系统，并通过浓度梯度　向周围长时间持续释放。万古霉素骨水泥在ｌ临床人　工关节置换等术式的局部抗感染及其应用的实验　研究中倍受关注，本文建立了高效液相色谱法检测　骨水泥缓释液中的万古霉素浓度，并对缓释浓度梯　度变化进行观察。　１材料与方法　１．１仪器与试剂　高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ，５１５泵，ＵＶ一７５００紫　外检测器，６５５Ａ一５２柱温箱，７７２５手动进样器，Ｕｐ—　ｐｅｒ色谱工作站。）Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＡＥＬ一４０ＳＭ精密分析　天平，ＬＧ１６一ｗ（京立）离心机。万古霉素标准品（中　国药品生物制品检定所），甲醇、乙腈（色谱纯，天津　四友），正己烷、磷酸二氢钾、氯化钠、碳酸氢钾、氯化　钾、磷酸氢二钾、氯化镁、盐酸、氯化钙、硫酸钠、Ｔｒｉｓ　＊通讯作者　（分析纯，天津化学试剂）。　１．２　方法　１．２．１　色谱条件　Ａｇｉｌｅｎｔ　ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ－Ｃ１８（４．６　×２５０　ＩＴｌｍ，５　ｍ），Ａｇｉｌｅｎｔ　ＺＯＲＢＡＸ　ＸＤＢ保护柱　（４×４　ｍｉｌｌ，５　ｔｚｍ）；流动相甲醇：乙腈：０．０５　Ｍ　ＫＨ２ＰＯ　（８：１：９１），流速１．０　ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长　２３６　ｎｍ，进样量２Ｏ　ｌ。　１．２．２溶液的制备模拟体液的配制：ＮａＣ１　７．９９６　ｇ，ＮａＨＣＯ３　０．３５０　ｇ，ＫＣ１　０．２２４　ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ　０．２２８　ｇ，ＭｇＣ１２。６Ｈ２Ｏ　０．３１５　ｇ，１　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣ１　４０　ｍｌ（ｐＨ７．４），ＣａＣ１２　０．２７８　ｇ，Ｎａ２ＳＯ４　０．０７１ｇ，　（ＣＨｚＯＨ）３ＣＮＨ２（Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．４）６．０５７　ｇ定容于　１　０００　ｍｌ蒸馏水中。标准储备液（１．１　ｇ／Ｌ）：精密称　取１１　ｍｇ万古霉素标准品，定容于１Ｏ　ｍｌ容量瓶中，　４。Ｃ保存。１００　ｆｆｇ／ｍｌ标准溶液配制：取０．１　ｍｌ（１．１　ｇ／Ｌ）标准储备液加人１　ｍｌ模拟体液中，混匀。１Ｏ　Ｆｇ／ｍｌ标准液配制：取０．１　ｍｌ（１００　ｆｆｇ／ｍ１）标准液加　入０．９　ｍｌ模拟体液中，混匀。流动相配制：精密称　取磷酸二氢钾（ＫＨｚＰＯ　）３．４　ｇ定容至５００　ｍｌ蒸馏　水中，用磷酸调ＰＨ为３．２，配制成０．０５　ｍｏｌ／Ｌ磷　酸二氢钾溶液。

　１．２．３样品采集和处理样品采集：取洁净的玻璃　容器加入足量的模拟体液，将万古霉素骨水泥样品　浸泡其中，密封容器开口，置于无菌环境中，每隔一　定时间摇匀，按设定时间点抽取浸泡液，每次抽取　０．５　ｍｌ样品，４℃保存。样品处理：样品１００００转离　心５分钟，取上清上样。　１．２．４　标准曲线　取标准储备液适量，加模拟体　液，使浓度分别为０．０，０．１，０．５，１．０，２．０，４．０，６．０，　

、Ｊ　＾“　．ｈ、　，＾　、ＪＭ　图１空白　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｊｕｌｙ，２０１７，Ｖｏｌ　２１，Ｎｏ．７　８．０，１０．０／￣ｇ／ｍｌ，按样品处理和测定方法测定。以　万古霉素峰高为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线，　根据标准曲线求出万古霉素浓度。　２　结果　２．１　色谱测定取空白模拟体液、万古霉素骨水泥　在模拟体液中浸出液样本、万古霉素试验液，在上述　实验条件下，经处理，测得ＨＰＬＣ色谱图。结果见　图。　

图２样品　图３标准　万古霉素ＨＰＬＣ色谱图　２．２方法的线性范围　配制浓度为０一ｌＯ／￣ｇ／ｍｌ的　万古霉素标准液，做线性范围测定。ｒ一０．９９２，万古　霉素在０—１０　ｐｔｇ／ｍｌ浓度范围内有良好线性关系。　２．３精确性试验选择高、中、低３个浓度，分别进　行批内和批间测定，ＲＳＤＯ均小于１Ｏ　。　２．４　准确性试验精密吸取模拟体液，分别加入定　量的万古霉素标准品，依法测定，回收率９６．７　。　２．５　干扰试验标准曲线以峰高为计算系数，万古　霉素骨水泥在模拟体液中的浸出液杂峰不干扰万古　霉素峰。　２．６浸出液浓度测定及观察　万古霉素骨水泥浸　泡于模拟体液中，定时振摇并取出样品，观察期３５　天，取得样品２０１例，对上述样品检测，最高浓度　７．５０￣ｇ／ｍｌ，最低浓度０．４０／，ｇ／ｍｌ，浓度多分布于　１．５－５／￣ｇ／ｍｌ。　３讨论　万古霉素骨水泥在模拟体液的浸出环境中，模　拟体液的多离子、骨水泥本身的合成材料慢性溶解、　样品稀释度高是影响万古霉素检测的主要因素，本　文用正己烷试图提取去掉干扰，发现干扰物非脂溶　性物质，应用沉淀剂和高速离心比较也没有较大改　善，调整流动相甲醇或乙腈的量，万古霉素目标峰明　显升高。随着观察取样时间的延长，药物不断溶出，　样品出现变色及絮状物沉淀，经高速离心样品仍有　较好的分离效果，第３０天后，样品变色较多，干扰物　质杂峰增多。对骨水泥包裹释放药效的观察不能完　全依照药物浓度，同时应综合考虑渗出液体物理性　状的改变。　参考文献：　［１］余洋，陈　莹，周一飞，等．骨折内固定术髓内感染患者应用万　古霉素骨水泥控制的效果研究［Ｊ］．中华医院感染学杂志，２０１５，　２５（２４）：５６６６．　Ｅ２］崔海珍，郭义明，于倩．ＨＰＬＣ法测定万古霉素血药浓度ＦＪ］．中　国药物应用与监测，２Ｏ１６，１３（５）：２６８．　Ｆｓ］宋庆华，赵望明，许安荣，等．万古霉素骨水泥治疗骨髓炎的Ｉ临床　疗效分析［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，２０１２，１８（６）：　５７０．　［４］祝永明，涂厉标，王真．互为内标法测定去甲万古霉素与万古霉　素的血药浓度［Ｊ］．中国医院药学杂志，２００５，２５（１２）：１１２６．　（收稿日期：２０１６—０７—２８）