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. 细菌总数检测操作规程
1 原理
试样经过处理，稀释至适当浓度，在一定条件（如使用特定的培养基，在温度30℃±1℃培养72h±3h等）下培养后，所得1g（mL）试样中所含细菌总数。
2 试剂与仪器
2.1 所用器具
三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器
2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅
2.3 所用试剂和培养基
营养琼脂
取营养琼脂32.0g，加入蒸馏水1L，搅拌加热 至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。
3、操作步骤
3.1 配制0.85%生理盐水。
称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。
3.2 三角烧瓶加入生理盐水90mL和玻璃珠，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）
3.3 将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺，121℃灭菌30min。（注意计算数量）
3.4 将枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。（1-3步需提前一天完成）
3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。以无菌操作取样品10g于含90mL生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。
3.6 用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。
3.7 另去一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支灭菌吸头。
3.8 选择2个~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。
3.9 稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀（从稀释试样到倾注培精品文档
平板菌落计数法
百科名片
平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
目录
一、菌落总数介绍：
二、检验方法
三、说明
一、菌落总数介绍：
二、检验方法
三、说明
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但是，由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ：colony-forming units），而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
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编辑本段一、菌落总数介绍：
菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌
落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
食品中细菌总数和菌落总数是怎么样测定的？
满意答案
ㄨ蓶羙╰菰° 9级 2009-11-02
一、菌落总数介绍： 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、检验方法 菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。 基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。 国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。 检验方法参见： GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》 SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数》 三、说明 （一）样品的处理和稀释： 1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
细菌总数的测定法
一、细菌数测定的基本概念
药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的重要指标，也是检测药品质量的重要指标之一。细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH 位、培养温度和时间等）每1g、lml、l0cm2 供试品液经培养后所生长的菌落数。所谓一定条件是按我国药典规定，在需氧条件下，30～35℃，一般培养48h,在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。细菌数的测定方法有多种：平板法、薄膜过滤法、涂抹法。
药品细菌数测定是活菌计数，最常用的平板法是以平板菌落计数为依据，即每个菌落代表个菌细胞，但有的菌落也可能是多个菌细胞形成，如双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等，很可能是多个菌细胞在一起。故准确地说，细菌数测定值实际上是菌落形成单位数( CFU)。
平板法菌落计数法，是受一定条件的限制：如供试液是否均质，供试液中的细菌是否充分分散；培养基的质量、培养温度及培养时间的影响；有繁殖能力的菌细胞才能形成菌落，死菌及某此受损伤的细菌或营养要求苛刻的细菌在规定的培养基上不能生长，因而不被计数。在试验操作中应考虑到这此问题。
二、设施、设备、仪器及器皿
1、设施
细菌数测定全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净净度l0000级和局部洁净度100 级单向流空气区域内进行，以防止再污染。
2、设备、仪器
恒温培养箱（30～35℃）、微波炉、匀浆仪（4000～10000r / min ）、康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃ ）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果验证并应定期请有关部门检定）
菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平（感量0.1g）、pH 值系列比色计、全封闭可拆卸或开放式的薄膜过滤器。
3、器皿
锥形瓶（250～300ml ）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×18mm）、刻度吸管（l ml , 10ml）、载玻片、玻璃或搪瓷、不锈钢消毒缸（带盖）。
