细菌种属的分子鉴定
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用16S rDNA方法鉴定细菌种属
一、目的
1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；
2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：
三、操作步骤
（一）细菌基因组DNA提取
1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μL TE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。
37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。
再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。
9. 加入50 μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。
12000 rpm离心2分钟，流下的
液体即为基因组DNA。
10. 电泳。
取3 μL溶液电泳检测质量。
（二）PCR扩增
1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
16S (F) 5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'
16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2. PCR扩增体系：
在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液：
16S (F) 1μL (10μM)
16S (R) 1μL (10μM)
10×PCR Buffer 5 μL
dNTP 4 μL
Taq酶0.5 μL
加ddH2O使反应体系调至50 μL，简单离心混匀。
3. PCR反应
将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。
扩增条件为：
94℃ 3 min
94℃30 sec
50℃45 sec 35 cycles
72℃100 sec
72℃7 min
4. PCR产物的电泳检测
拿出Eppendorf管，从中取出5 μL反应产物，加入1μL上样缓冲液，混匀。
点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。
电泳1 hr。
在紫外灯下检测扩增结果。
（三）扩增片段的回收
根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。
否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。
1）称量一2 mL.的Eppendorf管质量，记录。
2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的Eppendorf管内，称量。
计算凝胶质量。
3）每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。
60℃温育至凝胶融化
4）全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
5）加入500 μL Binding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6）加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7）再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8）加入30 μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。
12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。
（四）DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。
四、实验结果及分析
根据测序结果，到NCBI上进行比对，确定该未知菌的种属。
()
根据比对结果进行进化树的绘制。
写明所用软件及大致的分析方法。
分析讨论实验的过程及结果。
