分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项

菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。

5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。

而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。

在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。

因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。

随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。

细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

微生物的鉴定流程12传统微生物鉴定简述3分子生物学鉴定1.微生物的鉴定流程流程：传统分类鉴定法现代分类鉴定法2. 传统微生物鉴定简述鉴定指标:（1）菌落形态（2）菌体形态细菌：真菌：（3）理化特征淀粉水解实验代谢产物特征（4）不足传统的鉴定的主要依据是形态特征、理化特征、生态特征和血清学特征，需要进行微生物的培养及一系列生化反应或免疫学检测。

其缺点是检测项目多、工作量大、复杂耗时、结果不稳定，易出现弱反应或假阳性，存在明显的不足。

分子生物学操作简单，鉴定快速，且准确性高，现常用于菌种的鉴定。

3. 分子生物学鉴定16SrDNA鉴定法：利用了PCR的方法，根据16s rDNA两端的保守序列，设计引物PCR扩增未知细菌的16s rRNA基因，然后对PCR扩增的DNA片段进行序列分析，经与GenBank中的已知序列进行同源性比较后，对未知菌种进行鉴定。

该方法是在分子水平上对细菌进行的分类，具有快速、准确、重复性好等优点。

（1）具体流程：基因组的制备PCR 扩增 16sRNAPCR产物纯化阳性克隆鉴定，测序同源性分析，系统进化树建立（2）鉴定的原理细菌的rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占总量的80%以上，其分子量大，种类多，由高度保守区和可变区组成。

细菌的rRNA包括5S、16S、23S，其中5S rRNA信息量少，不适合分析；23S rRNA分子大，信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适于细菌鉴定；相比之下16S rRNA的遗传较为稳定，长度在1550±200bp左右,代表信息量适中，是研究系统进化的好材料。

目前已报道了15000种以上的细菌16S rDNA序列，通过对16S rDNA序列分析，可以将细菌划分到属或种，对于难以培养的细菌、生化反应不明显及传统表型方法不能鉴定的细菌，使用该法鉴定细菌尤为方便。

（3）鉴定的步骤①基因组DNA的制备从琼脂平板上挑出10个单菌落或从三角瓶中取200 μl菌液，采用细菌少量提取基因组DNA试剂盒提取各个样品的基因组DNA，4℃保存备做模板。

可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。

菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是微生物学中的重要研究内容之一，它主要是通过对菌株的形态、生理生化特性以及分子生物学特征进行综合分析，来确定菌株属于哪一类别。

菌种鉴定的准确性对于微生物学研究和应用都具有重要意义。

下面将介绍菌种鉴定的一般方法及步骤。

一、形态学鉴定1.菌落形态观察：将菌株接种在合适的培养基上，培养一定时间后，观察菌落的形态特征，包括菌落的形状、颜色、质地等。

2.细胞形态观察：将菌株制备成适当的涂片，使用显微镜观察菌体的形态特征，包括细胞的形状、大小、排列方式等。

二、生理生化特性鉴定1.生长条件观察：菌株在不同培养条件下的生长情况对其鉴定有重要意义。

可通过调节培养基的pH值、温度、营养成分等条件，观察菌株在不同环境下的生长情况。

2.代谢产物检测：菌株的代谢产物可以通过化学方法检测，如氧化酶、酸碱指示剂等。

三、分子生物学特征鉴定1.16S rRNA序列分析：16S rRNA是细菌特有的序列，通过测序并与数据库中已知的16S rRNA序列比对，可以确定菌株的亲缘关系。

2.DNA指纹图谱分析：通过PCR扩增菌株的DNA片段，然后使用凝胶电泳或者高通量测序技术进行分析，可以得到菌株的DNA指纹图谱，从而进行鉴定。

菌种鉴定的方法及步骤主要包括形态学鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学特征鉴定。

其中，形态学鉴定主要通过观察菌落和菌体的形态特征来确定菌株的分类；生理生化特性鉴定则是通过观察菌株在不同环境条件下的生长情况和代谢产物来进行鉴定；分子生物学特征鉴定则是通过分析菌株的DNA序列以及DNA指纹图谱来确定其亲缘关系。

这些鉴定方法可以相互补充，提高鉴定的准确性。

在实际应用中，可以根据不同需求选择合适的方法进行菌种鉴定，以确保准确性和可靠性。

菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是指通过对菌株样本进行系统学、形态学、生理学和生化学等各方面的观察与检测，以确定其属、种分类地位的过程。

菌种鉴定方法及步骤如下：2.制备纯培养物：分离并得到纯培养菌株，避免混杂的现象。

3.形态学观察：观察菌株的形态特征，包括菌落形态、菌落颜色、菌丝生长特征等。

4.微观形态学观察：观察菌株的细胞形态、孢子形态、菌丝形态等。

5.分类地位确定：通过对菌株的形态特征进行比对和研究，确定其属、种分类的地位。

1.生长条件观察：观察菌株在不同的生理因素（如温度、pH值、氧气含量等）下的生长情况。

2.营养需求观察：观察菌株在不同营养物质（如碳源、氮源等）的利用情况，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性。

3.生化特征检测：进行生化试验，如氧化酶试验、氧化发酵试验、内酯酶试验等，以检测菌株的生化特征。

4.产物检测：检测菌株的代谢产物，如抗生素、酶等，以判断其代谢途径和功能。

1.提取菌株基因组DNA：通过细菌培养物提取菌株的基因组DNA。

2.PCR扩增：使用特异性引物进行PCR扩增，选择适当的靶基因进行扩增。

3.DNA测序及分析：对扩增的DNA产物进行测序，利用生物信息学方法对测序结果进行分析和比对。

4.基因序列比对：将测序结果与数据库中已知菌种的基因序列进行比对，以确定菌株的分类地位。

四、传统鉴定方法的优缺点1.优点：传统鉴定方法操作简单，成本低廉；不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。

2.缺点：传统鉴定方法对菌株鉴定仅限于形态学、生理学和生化学等方面的观察，鉴定结果存在一定的主观性和局限性；需要较长的时间才能得到鉴定结果。

五、分子生物学鉴定方法的优势1.高精确性：分子生物学鉴定方法通过对菌株的基因序列进行比对，可得到较高的精确性，减少了主观性和局限性。

2.快速性：分子生物学鉴定方法在提取DNA和PCR扩增等步骤后，可以迅速得到鉴定结果，节省了时间。

3.可靠性：分子生物学鉴定方法的结果具有较高的可靠性，有助于解决传统鉴定方法在分类地位判断方面的困难。

是的，要做PCR。

首先你要提出细菌的DNA。

方法如下：1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。

吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP 管中，再加甘油（30-40%）进行保种。

（-80摄氏度保藏2年）2、提取DNA（CTAB法）：（1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。

（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。

（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。

（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl 溶液，混合后再65℃温育30min。

（6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。

（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min 离心5min将上清液转移到新的EP管。

（纯化作用）（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。

（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。

（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。

（11）电泳检测6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA 进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。

微生物检测技术的微生物鉴定方法与注意事项随着生物技术和医疗技术的快速发展，微生物检测技术在医药、环境、食品等领域的应用越来越广泛。

微生物鉴定是其中重要的一环，它可以帮助我们确定不同种类的微生物以及它们对环境和人类健康的影响。

本文将介绍微生物检测技术的微生物鉴定方法以及一些注意事项。

一、微生物鉴定方法1. 直接显微镜观察直接显微镜观察是最简单直接的微生物鉴定方法之一。

通过放大镜或显微镜观察微生物的形态、大小、结构等特征，可以初步确定微生物的类型。

这种方法适用于一些常见的微生物，如真菌、细菌和原生动物等。

2. 培养和生长特性观察培养和生长特性观察是一种常用的微生物鉴定方法。

通过将微生物样本培养在适当的培养基上，观察其生长特点、菌落形态和色素等特征，可以初步确定微生物的类型。

这种方法通常需要较长的培养时间，但可以识别更多种类的微生物。

3. 生物化学试剂盒检测生物化学试剂盒检测是一种常用的微生物鉴定方法。

这种方法利用不同微生物在特定条件下产生的酶或代谢产物与试剂盒中的反应物之间的反应，通过观察反应结果判断微生物的种类。

生物化学试剂盒检测方法可快速、准确地鉴定微生物，适用于临床检测和食品安全监测等领域。

4. 分子生物学技术鉴定随着分子生物学技术的发展，分子生物学技术鉴定成为微生物鉴定的重要方法之一。

例如，聚合酶链式反应（PCR）技术可以通过扩增微生物特定的DNA序列，从而确定微生物的种类。

另外，测序技术可以通过测定微生物的基因组序列，识别微生物的种类和亚种。

分子生物学技术鉴定方法准确性高，但需要专业设备和操作技巧。

二、微生物鉴定的注意事项1. 样品采集与保存样品采集是微生物鉴定的关键步骤之一。

在采集样品时，应注意避免污染和交叉污染，使用无菌容器和工具，并避免直接接触。

对于不同类型的样品，采集方法和处理方式也不同，应根据具体情况进行。

在样品采集后，应妥善保存，并尽快送往实验室进行检测，避免样品变质或污染。

2. 实验室安全措施在进行微生物鉴定实验时，实验室安全是至关重要的。

细菌鉴定流程
细菌鉴定流程一般分为以下几个步骤：
1. 样品收集：根据需要鉴定的细菌类型和来源，选择适当的样品收集方式。

样品可以是细菌培养物、体液、食物等。

2. 培养：将样品接种到适当的培养基上进行培养。

根据细菌的生长条件需求，选择适当的培养基，如富含寡营养物的普通培养基、特殊选择性培养基等。

3. 盱衡生长：根据细菌类型和特性，观察细菌的生长状况，如菌落形状、颜色、大小等。

4. 形态学鉴定：使用显微镜观察细菌的形态学特征，包括细菌的形状（球形、杆状、螺旋形等）、大小、菌落或细胞的结构、芽生等。

5. 生化鉴定：进行一系列生化试验以确定细菌的生化特性，如氧需求、发酵产物、酶反应、代谢产物等。

6. 免疫学鉴定：通过免疫学方法，如血清学试验、酶联免疫吸附试验等，检测细菌对特定抗体的反应性，以确定细菌的免疫学特性。

7. 分子生物学鉴定：应用分子生物学技术，如PCR（聚合酶链反应）、序列分析
等，检测细菌的DNA或RNA序列，以确定细菌的基因特征和亲缘关系。

8. 数据分析和鉴定：根据样品收集、培养、观察、试验等结果，综合分析得到的数据，确定细菌的鉴定结果。

可以参考细菌鉴定手册或数据库，进行对照确认。

这些步骤都需要进行严格的实验操作和分析，以确保细菌鉴定的准确性和可靠性。

不同类型的细菌鉴定流程可能会有所不同，具体流程可以根据实际需要进行调整和优化。

细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定是通过一系列方法和步骤来确定细菌菌种的过程。

以下是常用的细菌鉴定方法和步骤：
1. 收集样品：从目标环境或感染部位收集细菌样品，如血液、尿液、唾液、食物等，以便后续实验。

2. 培养：将细菌样品接种到适当的培养基上，提供足够的营养物质和环境来促进细菌的生长。

3. 纯化：将单个细菌菌落分离出来，并通过连续的传代培养使其得到纯化，以避免不同细菌种类的混杂。

4. 形态观察：观察细菌在固体培养基上的形态特征，如菌落的形状、颜色、大小等，以及在显微镜下的细胞形态，如形状、大小、结构等。

5. 染色：将细菌样品进行染色，如革兰氏染色、抗酸染色等，以便观察不同细菌的染色特征。

6. 生理生化试验：进行一系列生理生化试验，如代谢产物的产生、酶活性、氧需求等，以确定细菌的代谢特征。

7. 耐受性检测：测试细菌对温度、pH值、氧气和抗生素等环境因素的耐受性，以进一步确认鉴定结果。

8. 分子生物学分析：利用分子生物学技术，如PCR、序列分析等，通过对细菌的基因组或特定基因进行分析，来确定细菌的物种。

9. 鉴定结果：根据以上步骤的结果和参考文献，将细菌归类到已知的菌属或菌种中，最终得出细菌的鉴定结果。

需要注意的是，细菌鉴定是一个复杂的过程，通常需要准备鉴别试剂和设备，以及具备相关实验操作的技术和经验。

分子生物学方法鉴定微生物分子生物学是分子水平上研究生物学的一门学科，可以应用于微生物的鉴定和研究。

在分子生物学中，通过分析微生物的DNA、RNA和蛋白质，可以确定微生物的物种、进化关系和功能特性。

以下将介绍一些常用的分子生物学方法来鉴定微生物。

首先，核酸提取是分子生物学研究的基础步骤。

通过核酸提取可以获得微生物样本中的DNA或RNA。

一般常用的提取方法包括酚-氯仿法、离心法、磁珠法等。

提取得到的核酸可以用于后续的PCR扩增、测序、芯片分析等。

其次，PCR扩增技术是分子生物学中最常用的方法之一、通过PCR扩增可以在微生物样本中放大特定的基因片段，并进行进一步的分析。

PCR扩增主要包括两个步骤：变性和退火，其中变性是将DNA双链解开，退火是将引物与靶序列互补结合。

通过PCR扩增可以获得大量的特定基因片段，用于进一步的测序和鉴定。

PCR扩增得到的目标基因片段可以进行多种分析方法。

其中，序列测定是一种常用的方法。

通过测定PCR扩增得到的基因片段的序列，可以确定该基因片段在数据库中的匹配度，并据此确定微生物的物种。

此外，序列测定还可以通过比对进化树的构建，研究微生物的进化关系。

此外，还可以利用PCR扩增得到的基因片段进行限制性酶切分析。

限制性酶切分析可以将PCR扩增得到的基因片段在特定的酶切位点上切割成片段，并通过凝胶电泳进行分离和检测。

通过比较不同微生物基因片段的切割模式，可以确定微生物的物种和进化关系。

除了PCR技术外，还可以利用酶切多态性（RFLP）分析来鉴定微生物。

RFLP是一种对PCR扩增得到的基因片段进行限制酶切，并通过凝胶电泳对切割产物进行分离检测的方法。

不同微生物在特定限制酶切位点的序列差异可以通过RFLP分析来鉴定。

最后，还可以使用引物扩增反应-随机扩增的多态性DNA(RAPD)技术来鉴定微生物。

RAPD技术是一种利用随机引物扩增基因组DNA的特定区域，通过凝胶电泳分析扩增产物，根据扩增产物的差异进行微生物的鉴定。

院感细菌培养院感细菌培养是指对医疗机构内的细菌进行培养和鉴定，以评估医疗机构的院内感染状况。

院感细菌培养通常包括采集样本、培养细菌、鉴定细菌种类和进行药敏试验等步骤。

本文将详细介绍院感细菌培养的标准操作流程及相关注意事项。

一、样本采集1. 样本类型：常见的院感细菌培养样本包括血液、尿液、呼吸道分泌物、伤口分泌物等。

2. 采集方法：根据不同样本类型选择合适的采集方法，确保样本的纯净度和完整性。

3. 采集容器：使用无菌容器采集样本，并确保采集容器的密封性和标识清晰。

二、细菌培养1. 培养基选择：根据细菌种类和培养要求选择合适的培养基，如血琼脂培养基、MacConkey琼脂培养基等。

2. 培养条件：根据细菌种类和培养要求设置合适的培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度等。

3. 培养时间：根据细菌种类和培养要求确定合适的培养时间，通常为24-48小时。

三、细菌鉴定1. 形态学鉴定：通过观察细菌的形态特征，如菌落形态、菌体形状、颜色等，初步鉴定细菌种类。

2. 生理生化特性鉴定：通过进行一系列生理生化试验，如氧需求性试验、酶活性试验等，进一步鉴定细菌种类。

3. 分子生物学鉴定：根据细菌的基因序列进行PCR扩增和测序，以确定细菌的种属和亚种。

四、药敏试验1. 药敏试验方法：常用的药敏试验方法包括纸片扩散法、微量稀释法等。

2. 药敏试验药物选择：根据细菌的鉴定结果选择合适的抗生素药物进行药敏试验。

3. 结果解读：根据药敏试验结果判断细菌对不同抗生素的敏感性，指导临床合理用药。

五、结果报告1. 报告格式：将细菌培养和鉴定结果整理成标准格式的报告，包括样本信息、细菌种类、药敏试验结果等。

2. 报告解读：对细菌培养和鉴定结果进行解读，指导医疗机构采取相应的感染控制措施。

注意事项：1. 采样过程中要严格遵守无菌操作规范，避免污染样本。

2. 培养过程中要控制好培养条件，确保细菌能够正常生长。

3. 鉴定过程中要准确判断细菌的形态和生理生化特性，避免鉴定错误。

③ 核酸探针
广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生 物检测以及分子生物学许多领域。 所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的 一段单链DNA或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探 针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检 测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。 根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的 探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至 更大类群范围的微生物的检测或鉴定。 例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质 粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这 种引起人类性行为传播疾病的细菌。
16S rDNA微生物鉴定流程
培养微生物 提取基因组DNA rDNA序列测定
PCR扩增16S rDNA片段
分析比较
微生物之间的系统发育关系
从样品中分离提取总微生物DNA
从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这是进行PCR 扩增16S rRNA的前提。 一种方法是直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培 养富集后再进行提取，另一种选择是提取微生物细胞中的 rRNA。RNA的提取技术相对于 DNA的提取较为复杂，一般 多采用提取细胞总 DNA，但也可根据情况选择提取 rRNA。
微生物分子生物学鉴定
微生物分类学定义： 按微生物的亲缘关系和进化规律 把它们安排成条理清楚的各种分类单元 或分类群的科学。
微生物的鉴定


主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找 权威性鉴定手册 鉴定方法分四个水平：
1. 细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营 养要求及生长条件等 2. 细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、 光合色素等的分析 3. 蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应 等 4. 基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol%、转 化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA 核苷酸序列分析等

细菌的活化及培养1.将实验室用到的烧杯、锥形瓶、培养皿等实验器皿用超声机超声20min，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗干净，放入烘箱中烘干。

按照培养基成分配置液体培养基，分别调好pH值后,然后进行灭菌30min。

牛肉膏蛋白胨培养基配方接种：在超净工作台中，取1 mL的菌种加入液体培养基中，混匀，37℃恒温振荡培养12h。

2.菌种的保存（采用甘油保藏法）先取800uL的菌悬液于1.5mL的无菌离心管中，再加入200uL的灭菌甘油，用封口膜将离心管口封号，以上操作均在超净工作台中完成，然后将装有甘油和菌悬液的混合液在漩涡震荡以上混匀，保存至-78℃。

细菌DNA的提取采用TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒对单增李斯特菌进行基因组DNA抽提。

操作步骤如下：1）取细菌培养液1ml，1000rpm离心一分钟，尽量吸净上清。

2）向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第二步，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μl缓冲液（110μl TE缓冲液,70μl溶菌酶），37℃处理30min以上。

3）向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

4）加入220μl缓冲液GB(改良磷酸盐缓冲液)，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。

如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。

5）加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

细菌鉴定的方法和步骤细菌鉴定是确定或确认细菌属种的过程，它是微生物学中非常重要的一部分，有助于了解细菌的特征、生态习性和其对人类的影响。

下面，我将介绍细菌鉴定的一般方法和步骤。

一、准备实验室条件和材料在进行细菌鉴定之前，需要准备好实验室条件和所需的材料。

实验室应具备洁净、无菌环境，预防细菌污染。

所需的材料包括培养基、培养皿、平板、显微镜、油浸物镜、背景颜色固定剂、染色试剂、耗材等。

同时，实验人员需要佩戴实验手套和口罩，保证操作的无菌性。

二、选择适当的培养基不同的细菌在不同的培养基上生长出不同的菌落，因此选择适当的培养基是细菌鉴定的关键。

常用的培养基有营养琼脂培养基、血琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基等。

根据需要鉴定的菌株特性和需求，选择适当的培养基。

三、样品采集和拮抗在开始鉴定之前，需要采集样品并进行扩培。

样品来源可以是病人的体液、环境中的土壤、水源、食品等。

样品采集最好是在无菌环境中进行，避免外来的细菌干扰结果。

四、制备纯培养物为了获得纯种细菌，需要将样品进行拮抗并分离。

拮抗是指将细菌分离成单独的菌落，并在新的培养基上获得单个菌种的纯培养物。

常用的方法有稀释再悬浮平板法、分离斑点法、筛选法等。

通过将菌落接种到培养基上，经过单菌的选择和培养，最终得到纯种菌株。

五、观察菌落特征观察菌落形态是进行细菌鉴定的重要步骤之一。

菌落特征包括菌落大小、形状、质地、边缘、颜色等。

通常使用肉眼或显微镜对菌落进行观察，并记录下菌落的特征。

六、进行染色处理染色是细菌鉴定中常用的方法之一。

根据细菌细胞壁的性质，通常使用革兰氏染色、苏木精-伊红染色等常规方法进行染色处理。

通过染色，可以初步了解细菌的形态、结构和染色特性。

七、观察细胞的形态和结构将已染色的细菌样本放置在显微镜下，使用油浸物镜进行镜片调焦。

观察细菌细胞的形态特征，如形状（球形、棒状、螺旋形等）、大小、连杆性等。

此外，还可以观察细菌细胞的结构、附属结构（如鞭毛、菌毛等）以及内部结构（如胞浆、核质等）。

分⼦⽣物学鉴定细菌的⽅法具体操作步骤与注意事项16S rDNA鉴定细菌的⽅法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进⾏PCR扩增，电泳检测纯度与⼤⼩。

3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收⽬的⽚段5.⽬的⽚段测序。

6.BLAST⽐对获取相似⽚段。

7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌⽣长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前⽤TE缓冲液对菌体进⾏洗涤。

）。

2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），⾼温⾼盐灭菌后，室温保存。

冷却到室温后调pH，每升⾼1℃，pH⼤约下降0.03个单位。

3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，⽤NaOH调pH⾄8.0（约20g）,⾼温⾼压灭菌，室温保存。

4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。

1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。

⾼温⾼压灭菌，室温保存。

1×TE Buffer⽤10×TE Buffer稀释10倍即可。

5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，⽤浓盐酸调pH⾄7.2。

室温保存。

⽤之前在65℃溶解。

配置时要戴⼝罩。

6、5M NaCl：称292.2gNaCl，⾼温⾼压灭菌，4℃保存。

7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（⼗六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。

⽤之前在65℃溶解。

8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的⽐例加⼊异戊醇。

9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的⽐例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。

植物病原细菌鉴定实验指导一、实验目的了解植物病原细菌的分类与鉴定方法，掌握分离、纯化、鉴定菌种方法，培养技术和生化鉴定技术。

二、实验原理细菌的鉴定包括形态学、生理生化和分子生物学鉴定等。

一般细菌的形态学特征，如生长形态、荧光特性、大小观感、颜色、质地等特征对细菌种属的鉴定非常重要；生理生化鉴定主要通过细菌在不同培养基上的生长特性、代谢途径等指标；分子生物学鉴定主要通过PCR扩增等手段，对细菌基因组的DNA序列进行分析和比对，建立物种特异性的DNA指纹。

三、实验步骤1、样品收集和处理收集可能感染病原细菌的植物样品，如叶片、茎、根等，通常选择表现症状明显的植株或部位作为样品。

将植物样品取出，进行表面消毒处理，可使用0.1%次氯酸钠、70%乙醇等消毒液对样品进行表面消毒，去除植物表面微生物的影响。

2、分离与纯化将消毒后的植物样品移植到适宜的培养基中，如普通营养琼脂培养基，选用相应的富营养培养基有利于分离病原菌。

将培养皿放置在适宜的温度和湿度下进行培养，通常选用28℃，相对湿度为60%左右为适宜。

在植物样品污染细菌生长后，从单个菌落中分离纯化，将纯化后的菌株进行保存或进行进一步的鉴定工作。

3、形态学鉴定观察细菌菌落的形态、大小、颜色等特征，对细菌形态特征的精细观察非常重要。

如分泌物、粘质或胞外多糖的分泌，以及生物质塑性、溶胶的形成等细节观察是形态学鉴定的重要参考标准。

4、生理生化鉴定通过生理生化鉴定，了解细菌的生长特性和代谢途径，选用不同的培养基和筛选方法可以判断病原菌的代谢类型。

如选择碳水化合物代谢及活性酶的测定等手段，增加了进一步分类和鉴定细菌的能力。

5、分子生物学鉴定应用PCR技术，对从植物样品中提取到的细菌DNA进行扩增，基于特异性PCR产物筛选与目的DNA序列的核苷酸序列比对，可以非常准确地测定细菌所属属种。

四、实验注意事项1、实验室要保持清洁，保证实验环境卫生。

2、植物样品取自已知病害株，避免误判。

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM）分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。

（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。

（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。

（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。

（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。

每人负责六个月。

其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。

由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。

二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。

2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。

3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。

4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。

注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。

5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。

在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。

6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。

注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。

表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG 1 M 0.05-0.6 mM三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。