一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法

小鼠肝细胞培养一、实验目的：通过直接消化法分离小鼠肝细胞进行原代培养，从而得到体外培养的小鼠肝细胞,，并掌握细胞培养的方法与技术。

二、实验器材：年龄合适的小白鼠、解剖工具、75%酒精、D-Hanks、试管、吸管、离心机、0.2%IV 型胶原酶、1%PVP的消化液、过滤网、10%新生血清的DMEM培养基三、实验步骤：1、做好实验前处理（仪器的清洗与灭菌、培养基的配制等）。

2、将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗10秒钟。

3、用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并将其放入装有4℃的含双抗的D- Hanks 液中进行漂洗2次，之后在培养皿中用眼科剪子将鼠肝组织剪成1mm3 左右的小块, 放入试管中，用吸管吹打, 待组织沉淀后吸出上清, 如此反复 3 次,最后一次清洗后，将试管放入离心机800rp/min离心4min。

4、将离心后的试管取出后弃上清，加入10倍肝组织体积的含0.2% Ⅳ型胶原酶和1%PVP 的消化液后，封口，4℃冰箱过夜。

5、次日检查肝组织是否消化完全，消化完全者可用吸管吹打散开, 若消化不完全而吹打不开者,可重于37 ℃消化15min。

6、将消化完全的悬液经200目不锈钢网过滤到培养皿中，之后将过滤后的悬液装到一个5ml离心管中，之后向过滤后的悬液中加入含10%新生牛血清的DMEM培养基到5ml, 于4℃冰箱中静置20min 。

7、用吸管弃除悬液, 加入DMEM培养基至5ml, 以1000 转/ 分离心4min , 弃上清，如此反复3 次。

8、最后离心完后再加入2ml含10%新生牛血清的DMEM完全培养基，收集肝细胞于培养瓶中；9、最后加入相同的完全培养基, 于37℃、5%CO2条件下培养。

11、10h 后首次换液, 换以含50ml/L的新生牛血清的DMEM培养液, 以后每48h换液一次并依次降低胎牛血清含量至1%。

第1篇一、实验目的1. 熟悉小鼠肝脏解剖方法。

2. 掌握小鼠肝脏提取和保存方法。

3. 学习组织样品的制备和储存技术。

二、实验原理肝脏是人体重要的代谢器官，具有合成、储存、解毒等多种功能。

本实验通过解剖小鼠，提取肝脏组织，旨在为后续的实验研究提供材料。

三、实验材料与仪器1. 实验动物：健康成年小鼠一只。

2. 仪器：解剖剪、解剖针、手术刀、剪刀、镊子、培养皿、酒精棉球、生理盐水、福尔马林固定液、冰盒、解剖显微镜等。

四、实验步骤1. 实验动物处死：用酒精棉球擦拭小鼠，使其昏迷，然后迅速用剪刀剪断小鼠颈部，使小鼠死亡。

2. 解剖：将小鼠放入解剖盘中，用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹腔。

3. 提取肝脏：用解剖剪剪开肝脏周围的结缔组织，用镊子将肝脏轻轻夹出，放入培养皿中。

4. 清洗：用生理盐水冲洗肝脏表面，去除杂质。

5. 固定：将肝脏放入装有福尔马林固定液的培养皿中，浸泡固定。

6. 保存：将固定好的肝脏取出，放入装有酒精的容器中，密封保存。

五、实验结果与分析1. 成功解剖小鼠并提取肝脏组织。

2. 肝脏表面有明显的红褐色，质地柔软，易于夹取。

3. 肝脏表面无明显杂质，清洗过程中保持肝脏组织完整。

六、实验讨论1. 实验过程中，解剖操作要轻柔，避免损伤肝脏组织。

2. 肝脏固定过程中，福尔马林固定液浓度不宜过高，以免影响后续实验结果。

3. 实验动物处死过程中，要确保小鼠死亡，避免实验过程中出现意外。

七、实验结论本实验成功解剖小鼠并提取肝脏组织，为后续实验研究提供了可靠的组织样品。

在实验过程中，掌握了组织样品的制备和储存技术，为今后相关实验奠定了基础。

八、实验改进1. 在解剖过程中，可使用解剖显微镜观察肝脏结构，提高解剖效率。

2. 在肝脏固定过程中，可选用其他固定液，如4%多聚甲醛，以提高固定效果。

3. 在实验动物选择上，可根据实验需求，选用不同品种、年龄的小鼠。

第2篇一、实验目的1. 学习小鼠肝脏的解剖方法。

2. 掌握肝脏细胞的提取方法。

第1篇一、实验目的1. 了解小鼠肝细胞的基本形态结构；2. 掌握肝细胞分离、培养及观察的基本方法；3. 通过观察肝细胞在不同条件下的变化，探讨肝细胞的功能特性。

二、实验原理小鼠肝细胞是研究肝脏生理和病理的重要模型。

通过分离、培养和观察肝细胞，可以了解肝细胞的基本形态结构，以及在不同条件下的生理和病理变化。

本实验采用差速离心法分离小鼠肝细胞，并进行体外培养。

三、实验材料1. 小鼠：体重20-25克，雌雄不限；2. 培养基：DMEM培养基；3. 胎牛血清；4. 胰蛋白酶；5. 离心管；6. 离心机；7. 显微镜；8. 其他实验器材。

四、实验方法1. 分离肝细胞：（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏剪成小块，加入胰蛋白酶，消化肝细胞；（3）将消化后的肝细胞悬液过滤，收集滤液；（4）将滤液以1000 rpm离心5分钟，弃去沉淀；（5）将上清液以2000 rpm离心10分钟，收集沉淀，即为肝细胞。

2. 肝细胞培养：（1）将肝细胞用DMEM培养基洗涤，制成细胞悬液；（2）将细胞悬液以1×10^5个细胞/毫升的密度接种于培养瓶中；（3）置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

3. 肝细胞观察：（1）在显微镜下观察肝细胞的基本形态结构；（2）观察肝细胞在不同条件下的变化，如细胞形态、细胞器分布等。

五、实验结果1. 肝细胞形态：（1）肝细胞呈多边形，细胞核位于细胞中央，细胞质丰富，含有丰富的细胞器；（2）细胞间连接紧密，形成单层细胞。

2. 肝细胞在不同条件下的变化：（1）正常培养条件下，肝细胞生长良好，细胞形态稳定；（2）在缺氧条件下，肝细胞出现肿胀、空泡化等变化；（3）在肝损伤因子作用下，肝细胞出现变性、坏死等变化。

六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养小鼠肝细胞，为后续研究肝细胞的功能特性提供了良好的实验材料。

2. 肝细胞在正常培养条件下生长良好，表明肝细胞具有较强的生存能力。

3. 肝细胞在不同条件下的变化表明，肝细胞具有调节自身生理和病理状态的能力。

一种改良的简易灌注分离小鼠肝细胞的方法宋荣景;司霞;陈月;冯婉玉【摘要】目的探讨一种改良的简易灌注分离小鼠肝细胞的方法。

方法采用改良的简易两步灌注法分离小鼠肝细胞,即使用连有头皮针的注射器进行肝门静脉插管并灌流冲洗,再用Ⅳ型胶原酶灌流消化;分离肝细胞后采用室温静止法进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞存活率;培养板预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态;细胞贴壁后1~10d检测培养液上清液中的白蛋白的分泌情况,判断肝细胞的生物学活性和功能。

结果成功建立了一种简单易行的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。

培养的小鼠肝细胞在接种后4h基本完成贴壁,细胞可稳定贴壁至少1周,成活率可达85%以上且功能良好,可用于后续实验。

结论改良的简易两步灌注法是一种简单易行、经济高效的分离纯化小鼠肝细胞的方法,适合小鼠肝细胞的分离。

【期刊名称】《精准医学杂志》【年(卷),期】2018(033)006【总页数】4页(P539-541)【关键词】肝细胞;细胞分离;原代细胞培养;小鼠【作者】宋荣景;司霞;陈月;冯婉玉【作者单位】[1]北京大学人民医院药剂科,北京100044;[1]北京大学人民医院药剂科,北京100044;[1]北京大学人民医院药剂科,北京100044;[1]北京大学人民医院药剂科,北京100044;【正文语种】中文【中图分类】R446.113肝脏是人体重要的代谢器官之一，可参与多种生理病理过程[1-6]。

在肝脏行使的诸多功能中，肝细胞发挥了主要作用，原代培养的肝细胞更接近于机体内环境，因此成为许多体外实验的选择，但肝细胞的分离技术要求高、原代培养的肝细胞增殖能力差，不容易成功。

两步灌流法是分离肝细胞的经典方法[7]，该方法分离得到的细胞数量多、存活率及纯度也较高，但该方法所需的灌流装置复杂，操作技术要求高，耗时长，而且不适宜小鼠的肝细胞分离。

近年来有文献报道的Ⅳ型胶原酶消化法分离小鼠肝细胞，是一种不经血液灌流的酶直接消化法[8-9]，该方法简单易行，但与传统的灌流法相比，收获的肝细胞数量减少、纯度不够高。

小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。

肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。

因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。

一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。

贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。

单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。

这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。

三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。

二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。

在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。

其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。

细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。

其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。

细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。

同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。

三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。

目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。

Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。

小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：材料：小鼠器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

操作步骤：1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。

4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。

6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。

8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。

目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。

具体操作步骤如下：1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。

分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。

1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。

腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。

灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。

放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。

待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。

待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。

用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。

然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。

Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。

先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。

离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。

小鼠原代肝细胞提取步骤1. 引言1.1 背景介绍小鼠原代肝细胞是一种非常重要的细胞类型，可以用于研究肝脏相关的生物学问题。

肝脏是人体最大的内脏器官，具有重要的生理功能，如代谢、解毒、合成蛋白等。

研究小鼠原代肝细胞提取方法对于深入了解肝脏生理功能具有重要意义。

在过去的研究中，科学家们通过提取小鼠原代肝细胞，成功地模拟了肝脏在体内的功能，为肝脏疾病的研究提供了重要工具。

小鼠原代肝细胞也被广泛应用于肝脏细胞培养、药物代谢与毒性研究等领域。

小鼠原代肝细胞的提取方法的改进和优化对于促进相关领域的发展具有积极作用。

通过对小鼠原代肝细胞提取方法进行研究，可以更好地理解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢途径。

优化提取方法，提高细胞纯度和活力，将有助于更精确地进行实验研究，为临床治疗提供更有效的参考依据。

在这一背景下，研究小鼠原代肝细胞提取方法具有重要的意义和应用前景。

1.2 研究意义小鼠是常用的实验动物之一，其肝脏细胞具有一定的再生能力，并且与人类的肝脏细胞在生物学特性上有很多相似之处。

小鼠原代肝细胞提取具有重要的研究意义。

通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地研究肝脏细胞的生长、增殖和功能。

这对于深入了解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢具有重要意义。

小鼠原代肝细胞的提取可以为基因编辑技术、药物筛选等研究提供重要的工具和平台。

通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地模拟体内情况，从而加深对相关疾病的认识、寻找新的治疗方法。

小鼠原代肝细胞的提取对于肝脏生物学研究和药物研发具有重要的意义，有助于推动相关领域的进步和发展。

2. 正文2.1 小鼠原代肝细胞提取前准备工作小鼠原代肝细胞提取前准备工作是成功提取肝细胞的关键步骤之一，其主要目的是为了确保提取到的肝细胞具有较高的活力和纯度。

在进行肝细胞提取前，需要进行以下准备工作：1. 选择合适的小鼠模型：选择健康、年龄相仿的小鼠作为实验材料，确保实验结果的可靠性。

图片简介:本技术提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。

小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。

该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。

技术要求1.一种小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；所述原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；所述第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；所述第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；所述第三灌流，用第三灌流液进一步消化。

2.按照权利要求1所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流的灌流血管为肝门静脉。

三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；优选地，所述PBS的温度为36-37℃；优选地，所述小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；优选地，所述第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；优选地，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；优选地，所述第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。

4.按照权利要求1-3任一项所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎包括如下步骤：(1)结剪断十二指肠韧带；(2)结扎胆总管；(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺(7)结扎后腔静脉；(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨【摘要】目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。

方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。

结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。

结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。

【关键词】肝；枯否细胞；离心法，梯密度；小鼠，近交BABLc ；细胞分离肝Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。

肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。

近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。

如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。

而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。

本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。

试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。

1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES （美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI��1640培养基（美国Gibco公司）。