生物技术复习资料（完整整理版）

⽣物技术复习资料（完整整理版）

⽣物技术复习资料

第⼀章基因⼯程

⼀．专业符号Tetr 四环素抗性 R/M体系

Ampr 氨苄青霉素抗性 pBR322 质粒载体

M13 单链噬菌体载体 cosmid 科斯质粒

IPTG 异丙基-β-D硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA连接酶

EcoRI ⼀种限制酶 host 宿主

Plasmid 质粒 Ori 复制起始位点

vector 载体 cDNA 互补DNA

southern blot DNA印迹转移技术 MCS 多克隆位点

⼆．名词解释

⽣物⼯程bioengineering——利⽤⽣物有机体（包括微⽣物和动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞、细胞器）和组织成分（包括DNA、RNA、蛋⽩质、酶、多糖、抗体等），形成新的技术⼿段来发展新产品和新⼯艺的⼀种技术体系。也是采⽤先进⽣物学和⼯程学技术，有⽬的、有计划定向加⼯制造⽣物产品的⼀个新兴技术领域。

免疫分析法——免疫分析法是利⽤抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋⽩质、微⽣物等）的分析⽅法。

基因⼯程——指按照⼈们的意愿，在体外将核酸分⼦插⼊病毒、质粒或其他载体分⼦，构成遗传物质的新组合，并使之转⼊到原先没有这类分⼦的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖的新物种。其⽬的是为⼈类提供有⽤产品及服务。

感受态细胞——能从其周围摄⼊DNA的细胞称为感受态细胞。

同聚物加尾法——利⽤末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分⼦单链延伸末端的3‘-OH上。如果在⽬的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度⼀般10~40个残基。可以连接任何两段DNA分⼦的普遍性⽅法。

原位杂交技术——根据核酸杂交原理，利⽤基因探针检出培养板上重组转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。DNA接头——它是⼀类⼈⼯合成的⼀头具有某种限制酶粘性末端，另⼀头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短⽚段。

标记营救——SV40 DNA为载体的取代克隆⽅式⼜分为早期基因区域取代及晚期基因区域取代两种类型。晚期基因区域取代⽅式是以外源性DNA⽚段取代晚期基因区域，构成的重组DNA在宿主中可以复制，但不能产⽣重组病毒颗粒，因⽽采⽤早期基因缺失的SV40病毒突变种作为辅助病毒与晚期取代重组DNA或和感染宿主，则晚期区域取代重组DNA可获得标记营救，辅助病毒产⽣的晚期基因产物与重组病毒的早期基因产物⼀起可形成完整病毒颗粒。

早期区域取代⽅式是以外源性DNA⽚段取代早期基因区域，但重组DNA形成病毒颗粒与早期区域基因产物T抗原供应有关，故同样可采⽤晚期基因区域缺失的SV40突变种作为辅助病毒进⾏标记营救，即可形成完整病毒颗粒。R/M体系——⼤多数的细菌对于噬菌体的感染都存在⼀些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制(restriction)和修饰(modification)现象，简称R/M体系。

衔接物——指⽤化学⽅法合成的⼀段由10~12个核苷酸组成，具有⼀个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段⽚断。

同尾酶——虽来源各异，识别的靶⼦序列也各不相同，但都产⽣出相同的粘性末端的限制性内切酶，称为同尾酶。

基因⽂库——是将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产⽣的基因组DNA⽚段随机地同相应的载体重组、克隆，所产⽣的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。

启动⼦——启动⼦是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。转化Transformation——⾃然的转化是指将携带某种遗传信息的DNA分⼦引⼊宿主细胞，通过同源重组作⽤获得具有新遗传性状的⽣物细胞的过程，基因⼯程操作中的转化是泛指将重组DNA转⼊宿主中的⽅法。

多克隆位点——DNA载体序列上⼈⼯合成的⼀段序列，含有多个限制内切酶的单⼀识别位点。能为外源DNA提供多种可插⼊的位置或插⼊⽅案。

回⽂结构——双链DNA中含有的⼆个结构相同、⽅向相反的序列称为反向重复序列，也称回⽂结构。

同裂酶——识别顺序与切割⽅式均相同的限制性内切酶。

安慰诱导物——能⾼效诱导酶的合成，但⼜不被所诱导的酶分解的分⼦，如，IPTG是⼀种乳糖类似物，再⽆乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被称为β半乳糖苷酶的安慰诱导物。

衔接物连接法（linker）——将衔接物的5‘末端和待克隆的DNA⽚段的5’末端⽤多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作⽤使两者连接起来，接着⽤适当的限制酶消化具衔接物的DNA分⼦和载体分⼦，由此使两者都产⽣出彼此互补的粘性末端。DNA接头法（adaptor）——当DNA接头的平末端与平末端的外源DNA⽚段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分⼦，⽽易于连接重组的⽅法。

插⼊灭活效应——在基因⼯程早期使的某些载体(如pBR322)，这些载体本⾝有两个或更多个抗⽣素抗性基因和分布适宜的酶，即位点。⽤适当的酶处理DNA及载体，进⾏重组，即将外源DNA插⼊到某⼀抗性基因中，⽽使该基因失去抵抗某抗⽣素的表型。DNA-蛋⽩质筛选法——是⽤来专门检测同DNA特异结合的蛋⽩质因⼦的⼀种⽅法。这种⽅法能⽤于筛选并分离表达融合的克隆。合成这种融合蛋⽩的重组DNA分⼦中的外源DNA编码⼀种能专门同某⼀特定DNA序列结合的DNA结合蛋⽩质（DNAbinding protein）。

蛋⽩质⼯程——是指通过蛋⽩质化学、晶体学和动⼒学的研究，获取关于蛋⽩质物理、化学等各⽅⾯的信息，在此基础上，对编码该蛋⽩质的基因进⾏有⽬的的改造，并通过基因⼯程等⼿段将其进⾏表达和分离纯化，最终得到⽐天然蛋⽩质更好的产物。

三．填空题

基因⼯程载体的必备条件：1、具有有效运载能⼒

2、携带外源性⽬的基因前后在宿主内功能⾃主复制

3、在宿主内能控制外源基因表达活动

4、鉴定⽅便，装卸⼿续简单

5、能携带⼤⼩不同的外源性⽬的基因、载体分⼦量要⼩,运载能⼒要⼤

6、容易控制、安全可靠、稳定性好

常⽤的将重组DNA转⼊宿主细胞的⽅法：

细菌转化与转染、⾼压电穿孔法、聚⼄⼆醇介导的原⽣质体转化、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、原⽣质体融合、脂质体法、细胞核的显微注射法、激光打孔技术、基因枪法

基因⼯程基本步骤：1、获得⽬的基因

2、在体外获得形成重组DNA分⼦。

3、将重组DNA分⼦转移到适当的宿主细胞中，并与之⼀起增殖。

4、从⼤量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分⼦的宿主细胞克隆。

5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的⽬的基因，供进⼀步分析研究⽤。

6、将⽬的基因克隆到表达载体上，导⼊宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产⽣出⼈类所需要的物质。

E.coli表达系统中常⽤的强启动⼦：Lac、Trp、λPL、λPR [1）lac启动⼦2）trp 启动⼦3）tac 启动⼦]⽬的基因制备⽅法：⼀、基因分离的物理⽅法；⼆、鸟枪法(Shot gun) ⼜称霰弹法；三、cDNA⽂库的建⽴与基因的分离；四、基因组⽂库法；五、基因的化学合成；六、聚合酶链反应技术（PCR）

外源基因在宿主细胞中⾼效表达的关键因素：⼀、有效的转录起始；⼆、mRNA的稳定性；

三、有效地翻译启始；四、遗传密码应⽤的偏倚性；五、 mRNA的加⼯；六、 mRNA序列上终⽌密码的选择；七、表达质粒拷贝数及稳定性；⼋、外源蛋⽩的稳定性PCR主要步骤：1、⾼温变性：2、低温退⽕：3、适温延伸

常⽤的克隆载体：细菌质粒（Col E1质粒载体、pSC101质粒载体、pBR322、pUC质粒载体）、病毒DNA、噬菌体DNA[λ噬菌体DNA和柯斯载体(cosmid)及单链DNA噬菌体载体(M13)]DNA⽚段的连接⽅法：⼀、DNA连接酶和T4DNA连接酶；⼆、粘性末端DNA⽚段的连接（连接酶的作⽤）；三、平末端DNA⽚段的连接（同聚物加尾法、衔接物连接法、DNA接头连接法）

真核病毒载体的优点：（常⽤的有SV40病毒载体及昆⾍杆状病毒载体。）1、有很⾼的拷贝数；

2、强⼤的启动⼦，可保证外源基因的⾼效表达；

3、可保证糖基化。

四．问答题

基因获得的⽅法有哪些？各有哪些特点？

⼀、基因分离的物理⽅法：⼈们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，⽽富G≡C区仍维持双链。当利⽤单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富G≡C区的DNA⽚段。

⼆、鸟枪法(Shot gun)⼜称霰弹法：鸟枪法适⽤于原核细菌⽬的基因的克隆分离，优点：操作简单，命中率较⾼。缺点：盲⽬性⼤，阳性⽚段不⼀定正好是基因，样本多，可能会漏。

三、cDNA⽂库的建⽴与基因的分离：最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列，局限性——并⾮所有的mRNA分⼦都具有polyA结构；

细菌或原核⽣物的mRNA半衰期很短；mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；仅限于克隆蛋⽩质编码基因,没有内含⼦，不能⽤于真核表达。

四、基因组⽂库法：从基因组⽂库所分离获得的基因序列包含有内含⼦，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。

五、基因的化学合成：优点1、可以合成细菌偏爱的密码⼦2、可以定向改变个别氨基酸3、可以在两端加上需要的限制酶切点

4、可以通过⾃动化仪器合成。

六、聚合酶链反应技术（PCR）优点：1、操作简单；2、通⽤性好；3、成功率⾼cDNA⽂库的建⽴有哪些步骤?

1、分离表达⽬的基因的组织或细胞。

2、从组织和细胞中制备总RNA和mRNA

3、第⼀条cDNA链的合成

4、第⼆条cDNA链的合成

5、cDNA上接头的加⼊

6、双链cDNA与载体的连接

7、从众多的重组体中筛选出特定的基因

限制酶命名原则是什么?属名（⼤写）+种名（⼩写）+株名+分离序号

外源基因在宿主细胞⾼效表达的关键问题及其解决⽅案

⼀、有效的转录起始与基因的⾼效表达：选择强的可调控的启动⼦；

⼆、mRNA的稳定性与基因⾼效表达：1、利⽤RNase缺失的受体菌，2、mRNA的5’端与3’端的正确加⼯，提⾼mRNA的稳定性；

三、有效地翻译启始与基因的⾼效表达：1、⾸选AUG为起始密码⼦；2、正确的SD序列；3、 SD序列与起始密码⼦之间的距离以9±3为宜；4、除SD序列外，处于起始密码5’端的核苷酸应为A和U；5、如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA，能使翻译效率提⾼；

6、在翻译起始区周围的序列应不形成明显的⼆级结构。

四、遗传密码应⽤的偏倚性与基因⾼效表达：不同表达系统中，使⽤偏倚性密码，尤其对于基因编码序列的5’端使⽤偏倚性密码，能有效提⾼表达效率。

五、 mRNA的加⼯与基因⾼效表达：绝⼤多数较⾼等的真核基因含有内含⼦，这些内含⼦在mRNA的加⼯过程中，在细胞核中被加⼯去除⽽产⽣成熟的mRNA。但许多哺乳动物类细胞中外源基因的表达需要内含⼦存在，如果在转基因动物中表达外源基因时，最好⽤基因组基因⽽⾮cDNA。

六、 mRNA序列上终⽌密码的选择：1、⾸选UAA；2、⽤⼀串连的终⽌密码，⽽不是只是⼀个终⽌密码，以保证翻译有效终⽌。

七、表达质粒拷贝数及稳定性与基因⾼效表达：⼀般来讲，质粒拷贝数多，基因表达⽔平⾼；质粒稳定性⾼，表达好。

⼋、外源蛋⽩的稳定性与基因⾼效表达：1、通过组建融合基因，产⽣融合蛋⽩；2、产⽣可分泌的蛋⽩质；3、以包含体的形式表达；4、选择合适的宿主表达系统。

假如⽤⼤肠杆菌⽣产⼈的β-珠蛋⽩，必须经过⼏个基本步骤

分离获得β-珠蛋⽩的基因——组成重组质粒——转化⼤肠杆菌——筛选阳性克隆——阳性克隆⼤量增殖——分离提纯⽬的蛋⽩1）获得⽬的基因

2）在体外，将带有⽬的基因的外源DNA⽚段连接到能⾃我复制并具有选择记号的载体分⼦上，形成重组DNA分⼦。