土拉菌的实验室检测及分析技术研究进展

６８４中国人兽共患病学报ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ

ｏｆＺｏｏｎｏｓｅｓ

文章编号：１００２—２６９４（２００９）０７—０６８４—０５

土拉菌的实验室检测及分析技术研究进展＊

朱晓宇，海荣中图分类号：Ｒ３７８．６文献标识码：Ａ土拉弗朗西斯菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）属弗朗西斯菌属，能引起人或动物的土拉菌病（Ｔｕｌａｒｅ－ｍｉａ）。患者可见发热、淋巴结肿大、肺炎等症状。土拉菌在世界各地分布广泛，自然疫源地主要分布在北半球。目前，至少有包括中国在内的１８个国家曾经报导过人间病例。１９１１年，土拉菌在美国加利福尼亚被首次分离，并被命名为Ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ。此后多年，其分类学地位几经更改，并在最近的伯杰氏手册中被命名为Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ。目前，弗朗西斯菌属至少包括Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ两个种，而Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ又可分为ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ、ｎｏｖｉｃｉｄａ、ｍｅｄｉａｓｉａｔｉ—ｃａ等亚种ｕ’。ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亚种又称为Ａ型土拉菌，ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ也被称为Ｂ型土拉菌。土拉菌不但是广泛分布的人兽共患病，而且是被各国国防机构密切关注的生物战剂。近年来，对土拉菌的研究日益增加，而土拉菌的实验室检测及菌株特性分析技术也较上世纪有了飞速发展。本文将对近几年的研究进展及主要结论进行综述。１实验室检测技术现状１．１病原学检测对病原体的分离是确定土拉菌病的最直接证据。然而，鉴于对营养要求苛刻，生长缓慢、菌体小、感染力强等原因，直到今日，对土拉菌的分离仍然是难度较大的工作。土拉菌在３７℃生长缓慢，２８℃更不适于生长，而与之相似的其他细菌，如鼠疫菌、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ，都能在２８℃较好生长ｎ３。土拉菌属半胱氨酸缺陷型，只有在含有半胱氨酸的培养基上才能生长。土拉菌也不易在液体培养基中生长。在添加了半胱氨酸的液体培养基中，大量接种后培养２４ｈ，产量仍然很低ｎ３。土拉菌曾经从溃疡组织、淋巴节活组织、痰液中成功分离ｎ３。脑脊液、血液、尿液也都可以作为分离的标本旺。３’。此外，动物的肝、脾组织也是常见标本。３。很多培养基都可用于土拉菌分离培养。除了葡萄糖半胱氨酸血琼脂培养基外，巧克力培养基（ＣｈｏｃｏｌａｔｅＡｇａｒ）、含有羊血的Ｃｙｓｔｅｉｎｅｈｅａｒｔａｇａｒ（ＣＨＡＢ）、ＭｏｄｉｆｉｅｄＴｈａｙｅｒ—Ｍａｒｔｉｎ和Ｍａｒｔｉｎ—Ｌｅｗ—ｉｓ等培养基都可于土拉菌的分离培养，少数菌株还可用哥伦比亚血平板或胰酶大豆（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅｓｏｙ）

平板培养ｎ‘‘３。在ＣＨＡＢ平板上，土拉菌菌落的直

径大约２～４ｒｆｌｍ，呈绿色或白色，光滑湿润Ｈ３。从现场标本中分离土拉菌较为困难。过去从病畜尸体中分离土拉菌的成功率仅有３０％。１。最近，ＫｉｅｒｓｔｅｎＪＫｕｇｅｌｅｒ等人建议在疫情现场用ＣＨＡＢ

培养基进行土拉菌分离，其成功率可以达到９０％。此外，用添加有抗生素的ＣＨＡＢ培养基（ＣＨＡ＆Ａ培养基）可以抑制杂菌生长，是从受污染标本，甚至尿液标本，分离土拉菌的好方法。他们的经验还表明，若将现场标本浸入Ｃａｒｙ－Ｂｌａｉｒ培养基中，运输至实验室再进行分离，阳性率反而低于将标本直接低温冻存后再运输至实验室分离。其原因在于Ｃａｒｙ—Ｂｌａｉｒ培养基使标本中的假单胞菌、葡萄球菌、变形菌等杂菌得以大量繁殖，从而与土拉菌形成竞争。１．２分子生物学检测目前，ＰＣＲ及巢式ＰＣＲ仍然是较常用的快速检测方法。除１６ＳｒＲＮＡ基因

外，编码外膜蛋白的ｆｏｐＡ基因、琥珀酸脱氢酶基因座的ｓｄｈＡ基因及编码１７ｋＤａ脂蛋白的ｔｕｌ４基因都已经被用做检测土拉菌的靶位点（表１）“。６３。在中国的４２０只鼠类标本中检测ｆｏｐＡ基因，其阳性率为４．７６％，其中来自吉林省的标本阳性率为１１．６５％，新疆的标本为１０．ｏｏ％，黑龙江为６．５６％，内蒙古为１．７７％ｕ３。通过序列比对也证实，所检测到的阳性片段均属ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ亚种。ｔｕｌ４、ｆｏｐＡ都是在荧光定量ＰＣＲ检测中常用的靶点（表２）。１∞。此外，土拉菌基因组的插入序列ＩＳＦｔｕ２及编码２３ｋＤａ蛋白（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｇｒｏｗｔｈ１０—

ＣＵ８Ｃｐｒｏｔｅｉｎ）的ｉｇｌＣ基因都已经成为研究者的关注对象ｏ’。相比传统的ＰＣＲ方法，荧光定量ＰＣＲ的优势不仅在于其高特异性、高灵敏性或短时快速性，更有前景的是其多靶点性。通过在探针上标记

＊国家科技重大专项资助（项目号：２００８ＺＸｌ０００４－０１０）通讯作者：海荣．Ｅｍａｉｌ：ｈａｉｒｏｎｇ＠ｉｃｄｅ．ｃｎ作者单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控饲所，传染病预防

控制国家重点实验室．北京１０２２０６

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表２常用的荧光定量ＰＣＲ引物及探针

不同的荧光物质，荧光定量ＰＣＲ可以实现在一次反应中同时检测三个目标基因。美国疾控中心（ＣＤＣ）的研究组在疫情处理时常常同时检测ＩＳＦｔｕ２、ｉｇｌＣ和ｔｕｌ４三个基因０３。而加拿大公共卫生署（ＰｕｌｂｉｃＨｅａｌｔｈＡｇｅｎｃｙｏｆＣａｎａｄａ）也已经能够从一次反应中检测包括土拉菌在内的三种病原菌。对于荧光定量ＰＣＲ，现场的应用和普及较难达到。有些探针和引物已经开始在便携式的荧光定量ＰＣＲ仪中尝试应用并取得较好效果，具有一定前景ｎ∞。１．３血清学检测由于分离培养给检测人员带来感染风险，血清学方法在很长一段时间都受到重视。在发病两周之后，患者体内可以产生抗体，而利用乳胶凝集、ＥＬＩＳＡ、免疫荧光、免疫组织化学及胶体金免疫层析等方法均能对土拉菌及其抗体进行检测ｎ１。１∞。针对土拉菌的单克隆抗体在上世纪９０年代已经成功研发，然而早期研发的单克隆抗体绝大部分都识别土拉菌的脂多糖（表３）ｎ¨钉。进入本世纪后，

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不断有新的单克隆抗体问世。这些抗体中有些已经可以识别ＬＰＳ之外的蛋白。单克隆抗体Ｆｔ９不与ＬＰＳ抗原反应，与全菌甲醛固定抗原杂交可出现１３条典型的糖蛋白梯形印迹带ｏ∞。近来还发现了Ｍ１１Ｄ３、Ｍ１３８１０、Ｓ１１Ｅ７和Ｕ２２Ｆ２单克隆抗体，也能识别不同分子量的土拉菌蛋白ｎ∞。土拉菌的特异性抗原也不断被发现（表４）。较早的研究已经确定了土拉菌１７ｋＤａ和４３ｋＤａ的外膜蛋白，它们直至今日仍被广泛应用于土拉菌的检测及鉴定。这两个蛋白分别由ｔｕｌ４和ｆｏｐＡ基因编码。ＴＵＬ４是一种脂蛋白，可以刺激土拉菌免疫病人的淋巴细胞增值，特别是激活ＣＤ｝细胞，进而产生ＩＬ一２和ＩＦＮ－７。ＦｏｐＡ蛋白可以协助诱导小鼠产生抗体，但是其本身并不能产生抗原保护作用ｎ刀。用蔗糖密度梯度离心分离蛋白时，土拉菌外膜蛋白主要分布在１．１７～１．２０ｇ／ｍＬ范围内ｎ们。这种方法可以分离到包括ＴＵＬ４和ＦｏｐＡ在内的至少１５种外膜蛋白。结合蔗糖密度梯度、双向电泳免疫印迹杂交及质谱分析等技术发现，土拉菌的ＦｏｐＡ、ＴＵＬ４、ＧｒｏＥＬ，ＫａｔＧ、ＰｉｌＱ、ＯｍｐＡ、ＡＴＰ合成酶等蛋白都能与小鼠抗血清发生反应，说明这些蛋白具有免疫原性。此外，用病人血清与土拉菌ＬＶＳ疫苗株进行双向电泳免疫印迹杂交也发现ＴＵＬ４、６０ｋＤａ伴侣蛋白ＧｒｏＥＬ及１０ｋＤａ伴侣蛋白ＧｒｏＥＳ等蛋白都具有免疫原性ｎ盯。蛋白质芯片及生物信息学技术也已经应用于土拉菌特异性抗原的研究中。利用病人抗血清与点有土拉菌蛋白的生物芯片杂交，发现了至少１５种抗原蛋白ｏ∞。生物信息学方法预测这些蛋白大部分与细胞膜或表面相关，进而提示这些蛋白可能具有免疫原性，具有血清学诊断的应用前景。２菌株特性的实验室分析进展２．１生化反应特性对于新分离的菌株，生化反应

裹３部分已经研发成功的单克隆抗体表４多次证据显示具有免疫原性的蛋白特性仍是最基本信息之一（表５）。通过甘油发酵反应可将Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ分为Ａ、Ｂ两个亚型ｏ”。Ａ型为甘油发酵阳性，即ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亚种；Ｂ型为甘油发酵阴性，即ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ亚种。吲哚、尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶、蔗糖、硫化氢产物等指标都曾被用来分析土拉菌的种间差异。’。在这些生化反应中，Ａ型土拉菌与Ｂ型土拉菌均为阴性（表５）。ｎｏｖｉｃｉｄａ亚种的蔗糖反应为阳性，甘油酵解在不同菌株间有一定差异。Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ的吲哚、氧化酶、蔗糖及硫化氢产物均为阳性。此外，在６％或６．５％氯化钠中的生长状况也可作为描述土拉菌的指标。Ｔｕｌａ—ｒｅｎｓｉｓ亚种在６％或６．５％的氯化钠中不生长，而有些ｎｏｖｉｃｉｄａ亚种或Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ可见阳性结果。此外，近来报导的某些弗朗西斯菌属的新种也有其独特的生化特性（表５）ｏ㈣。

表５部分弗朗西斯菌的生化反应特征

十，反应阳性；一，反应阴性；Ｗ，反应较弱；Ｖ．在不同菌株问有差异；ＮＤ，没有检测．　万方数据２００９，２５（７）中国人兽共患病学报ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｎｏｓｅｓ６８７

２．２遗传学特征２．２．１基因序列差异分析像其它细菌一样，１６ＳｒＲＮＡ序列往往是描述土拉菌的遗传学特性的首要选择。根据１６ＳｒＲＮＡ序列比较可知，土拉菌ｔｕｌａ－ｒｅｎｓｉｓ亚种与ｍｅｄｉａｓｉａｔｉｃａ亚种最为相近，他们都可能与Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ有紧密的亲缘关系。’。土拉菌ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ亚种的基因序列略有变化，而Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ的变化更大。ＰＰＩａｓｅ基因（Ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌｅｉｓ—ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒ—ａｓｅｇｅｎｅ）序列也是被分析的靶基因。对该基因编码区中的２１３核苷酸的序列分析也可以得到与１６ＳｒＲＮＡ序列分析相似的结果。土拉菌ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ亚种与ｎｏｖｉｃｉｄａ亚种的序列最接近，其次为ｔｕｌａｒｅｎ－ｓｆｓ亚种，而与Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ的序列差异最大∞∞。此外，在不同菌株中，该基因编码区下游可能有较大变异。仅ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ和ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ两亚种之间就相差三十碱基旺∞。其它已知的基因，如ｔｕｌ４、ＩＳＦｔｕ２及ｉｇｌＣ基．因，也都是研究者调查的指标。黝。除Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉ－ｒａｇｉａ的有些株之外，大部分弗朗西斯菌属菌株都含有ＩＳＦｔｕ２基因。此外，目前发现的Ａ型和Ｂ型土拉菌以及ｎｏｖｉｃｉｄａ亚种都含有ｔｕｌ４及ｉｇｌＣ基因，而多数Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ菌株都不含有这两个基因。在含有ｔｕｌ４的菌株中，其序列在同种之间较保守而在不同种之间也有一定差异。２．２．２基因组差异区段分析近年的研究表明，多位点串联重复序列（ＶＮＴＲ或ＭＬＶＡ）分析对来自世界各地的菌株均有较高的可行性∞们。根据２５个位点的信息可将Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ分为Ａ．Ｉ和Ａ．ＩＩ两群，将ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ亚种分为Ｂ．Ｉ、Ｂ．ＩＩ、Ｂ．ＩＩＩ、Ｂ．ＩＶ和Ｂ．Ｖ五个群。除美国北部的菌株外，斯洛伐克、加拿大的一些菌株属于Ａ．Ｉ群。Ａ．ＩＩ群包括了美国和加拿大的菌株。绝大部分亚洲和欧洲的菌株均属于Ｂ型的各群。此外，ＮＶＴＲ分析还发现，在同一次疫情暴发中分离的各菌株具有相同的遗传特征。对美国的ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亚种的分析也进一步证实Ａ．Ｉ和Ａ．ＩＩ的存在，Ａ．Ｉ与ｎｏｖｉｃｉｄａ亚种较为接近，而Ａ．ＩＩ与ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ亚种较接近姑们。更重要的是，Ａ．Ｉ型主要分布在美国东部，Ａ．Ｉｌ型主要分布在西部．且这种分布规律与两种主要野兔宿主Ｓ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ和Ｓ．ｎｕｔｔａｌｌｉｉ有对应关系，进而提示Ｓ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ可能是Ａ．Ｉ型的重要宿主，而Ｓ．ｎｕｔｔａｌ一例则可能是Ａ．ＩＩ型的重要宿主。此后，Ｓｔａｐｌｅｓ等人又用脉冲场电泳（ＰＦＧＥ）对Ａ型土拉菌的病人分离株进行了分析。盯。结合地理及临床资料，他们提出Ａ．ＩＩ感染对人的威胁要轻于Ａ．Ｉ型或ｈｏｌａｒｃｔｉ－Ｃａ亚种的感染。最近的研究更进一步发现，Ａ．Ｉ和Ａ．ＩＩ菌株的基因组之间至少存在１３处差异区段Ⅲ’。最近的一项分子流行病调查显示，来自黑龙江、吉林、内蒙古的３３份阳性标本的Ｆｔ—Ｍ３基因座共有７种基因型，重复数在七至十五之间旺∞。其中，七次重复的基因型在ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ亚种中尚属首次发现，而过去这种基因型往往在ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亚种中才能检测到。ＰＦＧＥ也可以将弗朗西斯菌区分为多种型别。钉。Ｘｈｏｌ酶切可以将弗朗西斯菌分为五种菌型，而利用ＢａｍＨＩ可以分为四种型。若用ＸｈｏＩ和ＢａｍＨＩ双酶切，则４９株分离株可被分为七个群（表６）。其中，大部分ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ菌株属于ＩＩＩ群，主要分离自西班牙和捷克。Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亚种均属于Ｉ群，ｎｏｖｉｃｉｄａ亚种和Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ分别属于ＶＩ群和ＶＩＩ群。分离自美国的菌株分别属于Ｉ、Ｖｌ、ＶＩＩ群，而分离自俄罗斯的菌株属于Ｖ群。扩增片断长度多态性分析（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＦｒａｇ—