羟基红花黄色素

羟基红花黄色素A的提取及含量测定*杨辉1**,阿依吐伦#斯马义1***,吴桂荣1,杨晓君2(1新疆医科大学药学院药物化学教研室,新疆乌鲁木齐830011;2新疆农业大学药学院,新疆乌鲁木齐830052)摘要:目的:对羟基红花黄色素A进行提取工艺改进。

方法:采用ZT C-Ò型澄清剂甲、D-4020型大孔吸附树脂和Sephadex L H-20柱层析法,从红花中提取分离羟基红花黄色素A单体,采用高效液相色谱法(H PL C)测定羟基红花黄色素A的含量。

结果:采用H PL C法测定羟基红花黄色素A的平均含量为97.3%。

结论:此工艺具有成本低、纯度较高的优点,可以作为羟基红花黄色素A的提取工艺使用。

关键词:红花;羟基红花黄色素A;提取工艺;H PL C中图分类号:R914;R927.2;Q949.783.5文献标识码:A文章编号:1009-5551(2008)10-1358-03 Study on extracted technology of hydroxysafflor yellow A in Carthamus tinctriusYANG Hui,Ayitulun#Simayi,W U Gu-i rong,et al(College of Phar macy,X inj iang M edical Univer sity,Ur umqi830011,China)Abstract:Objective:T o establish the technolo gy o f ex tr actio n o f H SYA.Methods:Detected the content of H SYA in Emin Carthamus tinctr ius L.by using the H PLC method.Extracted and separated H SYA from Carthamus tinctorius L.by using clarifier,D-4020macr opo rous resin column chrom ato graphy and Sepha-dex LH-20chromatog raphy.Results:T he m ean purity o f H SYA w as97.3%.Conclusion:T he techno logy makes clear that the m ethod w as cheap and the purity is hig her.T his technique is suitable to prepare H SYA.Key words:Carthamus tinctrius L.;hydrox ysafflor yellow A;extracted technolog y;high perform ance liq-uid chrom atog raphy红花为菊科植物(Car thamus tinctor ius L.)红花的干燥管状花。

红花对于防治心脑血管疾病有显著药效,是当今世界研究和应用的/热点0植物之一,红花中黄酮醇类和查耳酮类化合物是红花中较多的成分[1]。

有关研究表明,红花的主要有效部位红花黄色素(20%~30%))))水溶性查尔酮类混合物,具有活血通经、化瘀止痛之功效,对冠心病、血管栓塞性疾病、高血压、糖尿病等并发症有疗效,并具有镇痛、抗炎和抗肿瘤等作用[2,3]。

其中羟基红花黄色素A(H SYA)为红花黄色素中含量较高,具有药理效应代表性,且为单体,无明显的毒副作用,有着极好的新药开发前景[4]。

设计合理的H SYA提取工艺和有效利用资源具有极大的现实意义和广阔的发展前景。

本试验采用高效液相色谱法(H PLC)对H SYA含量进行测定。

通过对红花提取物除杂过程和分离纯化过程的优化,确定合理的H SYA提取工艺。

1仪器与试药美国Per kin Elmer200高效液相色谱仪,Sino-chro m ODS-BP柱(5L m,150mm@4.6m m)及保护柱(大连依利特科技有限公司),Waters2487紫外检测器,红花采自新疆塔城额敏县,经新疆农科院王兆木教授鉴定为菊科植物红花(Cartham us tinc-torius L.)的干燥花,D--4020型大孔树脂(天津南开大学化工厂),聚酰胺薄膜(浙江台州四甲生化塑料厂),葡聚糖凝胶Sephadex LH--20(Phar macia 公司),ZTCÒ型天然澄清剂(天津天成澄清剂有限公司),羟基红花黄色素A对照品为本室自制,1358新疆医科大学学报JOU RN A L OF XIN JI AN G M ED ICAL U N IV ERSIT Y2008Oct.,31(10)* ** ***基金项目:新疆维吾尔自治区高校科研计划科学研究重点项目(XJEDU2006137)作者简介:杨辉(1975-),女,主管药师,硕士研究生,研究方向:地方植物开发与研究。

本人现在乌鲁木齐市第四人民医院工作。

通讯作者:阿依吐伦#斯马义:教授,E-m ail:aytulun ss@。

H PLC法分析其纯度为98%。

2方法与结果2.1羟基红花黄色素A含量测定2.1.1色谱条件Sinochrom ODS-BP柱(5L m, 150mm@4.6m m),流动相:甲醇)乙腈)0.7%磷酸溶液(26B2B72),检测波长403nm,柱温25e,流速1.0m l/m in。

2.1.2对照品溶液和供试液的制备对照品:精密称取羟基红花黄色素A对照品0.00345g,置于25 ml容量瓶中,加25%甲醇定容,成为0.138mg/ml 的对照品溶液,经0.45L m微孔滤膜滤过,即得。

供试液:取红花粉末(过60目筛)约0.4g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入25%甲醇溶液50 ml,称定重量,超声处理(功率250W频率59KH z) 40min,放冷再称定重量,用25%甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,再经0.45L m微孔滤膜滤过,即得。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10L l,注入液相色谱仪,测定。

2.1.3标准曲线的制备分别取对照品溶液5、10、15、20、25、30、35L l,进样测定,记录峰面积,绘制标准曲线,计算回归方程:Y=2722613X-565 (r=0.9999)[X为羟基红花黄色素A的绝对进样量(L g),Y为峰面积]。

羟基红花黄色素A在进样量为0.69~ 4.83L g范围内具有良好的线性。

2.1.4精密度试验取同一供试品溶液10L l,连续进样6次,测定记录色谱峰面积,计算精密度。

RSD为1.0%。

2.1.5稳定性试验取同一供试品溶液分别在0、2、4、6、8、10、24、36、48h进样测定,记录峰面积值,计算精密度。

RSD为1.0%。

2.1.6重现性试验取同一批样品6份,按供试品制备方法制备,测定,记录峰面积,计算含量。

结果平均值为1.02%,RSD为1.86%。

2.1.7回收率试验精密称取9份已知含量的红花粉末(含H SYA量为1.02%)0.25g,置具塞锥形瓶中,分成3组,每组分别加入浓度为1.112mg/ml 的H SYA对照品储备液3.0、5.0、7.0ml,加入25%甲醇溶液使得溶剂总量为50ml,按2.1.2项下供试品溶液制备方法处理,进样10L l,测定峰面积并计算回收率。

平均收率100%,RSD为0.3%。

2.2水提液的制备称取200g红花药材,加入13倍量的蒸馏水,80e水浴浸泡20m in,提取2次,合并提取液。

2.3粗提物的制备2.3.1澄清剂法除杂将上述水提液浓缩比例为1B 2,加入8%ZT CÒ型澄清剂甲,絮凝60m in。

过滤,除去沉淀,60e以下减压浓缩至提取液含生药1.0g/m l。

2.3.2大孔树脂法除杂将除杂后的浸膏上D-4020型大孔吸附树脂,采用上样量(g/m l)与树脂用量比为0.5B10(W B V),树脂层析柱的直径与高度比为1B9,洗脱速度为1ml#1m in-1#cm-2,先用蒸馏水洗脱,待流出液M olish反应基本呈阴性时以10%乙醇洗脱,以H SYA为对照品进行聚酰胺薄膜法检视,至H SYA单一成分洗脱结束为止。

收集H SYA流份,浓缩备用。

2.4聚酰胺薄膜分析取聚酰胺薄膜,点样后以乙酸乙酯)甲醇)3.6%盐酸(1B3B6)为展开剂于密闭容器中上行展开,在254nm紫外灯下观察斑点荧光。

2.5羟基红花黄色素A的分离纯化2.5.1将由大孔树脂除杂过的红花粗提物上sephadex LH-20层析柱(2cm@40cm),径高比固定为1B15,流速固定为40s/d,分别以1%、2%、3%的柱体积(即0.94m l、1.88m l、2.83ml)上样。

结果上样量在柱体积的2%即到达饱和(表1)。

表1不同上样量对HSYA指标的影响上样量(m l)总体积(ml)进样体积(L l)H SYA峰面积HSYA量(峰面积计)0.9421103935690 5.90@1091.8835104610088 1.15@10102.8336104620552 1.61@10102.5.2将由大孔树脂除杂过的红花粗提物上sephadex LH-20层析柱(2cm@40cm),上样量固定为2%,流速固定为40s/d,同时以径高比1B9、1B 12、1B15(即柱高18cm、24cm、30cm)上样。

结果径高比在1B15纯化效率高(表2)。

表2不同径高比对HSYA指标的影响径高比总体积(ml)进样体积(L l)H SYA峰面积H SYA量(峰面积计) 1B920102242670 4.49@1091B12241035596728.54@1091B1533104696233 1.55@10102.5.3将由大孔树脂除杂过的红花粗提物上sephadex LH-20层析柱(2cm@40cm),上样量固定为2%,径高比固定为1B15上样,同时以10s/d、25s/d、40s/d洗脱上样。

结果流速控制在40s/d 为宜(表3)。

表3不同流速对HSYA指标的影响流速(s/d)总体积(ml)进样体积(L l)H SYA峰面积HSYA量(峰面积计) 10181048960728.81@1092524104716624 1.13@1091359新疆医科大学学报JOU RN A L OF XIN JI AN G M ED ICAL U N IV ERSIT Y2008Oct.,31(10)2.5.4 按照上述经sephadex LH -20层析柱优化出的工艺,反复5次上柱分离,得H SYA 粉末,采用H PLC 归一法测定羟基红花黄色素A 的平均含量为97.3%。