鸸鹋性别鉴定的分子标记方法

第４１卷第６期　

２０１０年６月　东北农业大学学报　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　４ｌｆ６）：８５－８９　

Ｊｕｎｅ　２０１０　

鸸鹋性别鉴定的分子标记方法　

付　晶，白秀娟　

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨一１５００３０）　

摘要：试验建立了平胸总目鸟类鸸鹋的快速、简单、准确的性别鉴定方法。利用非伤害性取样方法，从鸸　

鹋羽毛中提取了基因组ＤＮＡ，经１８对与性别相连锁引物组合的筛选，最终筛选出１对有效引物，对３对已知性　别鸸鹋及６Ｏ只未知性别鸸鹋的基因组ＤＮＡ进行特异性扩增。结果表明，这对引物组合在雄性鸸鹋中未扩增出片　

段，而在雌性鸸鹋中扩增出ｌ条片段，其片段长度为５３６　ｂｐ。由此可知，这对引物组合可以对鸸鹋性别作出准确　

鉴定。　关键词：平胸鸟类；鸸鹋；性别鉴定；分子标记　

中图分类号：￥８３９；Ｑ５０３　文献标志￣ｉ－５：Ａ　文章编号：１００５－９３６９（２０１０）０６－００８５—０５　

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｓｅｘ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＥｍＵ／ＦＵ　Ｊｉｎｇ，ＢＡＩ　Ｘｉｕｊｕａｎ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　

Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１　５００３０，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｍｕ（Ｄｒｏｍａｉｕｓ　ｎｏｖａｅｈｏｌｌａｎｄｉａｅ）ｉＳ　ｒａｔｉｔｅ　ｂｉｒｄｓ．Ｂｅａｃｕｓｅ　ｔｈｅ　ｍａｌｅ　ａｎｄ　ｆｅｍａｌｅ　Ｅｕｍ　ｈａｖｅ　

ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｍｏｒｐｈｏｕｓ，ｉｔ＇ｓ　ｄｉｆｉｃｕｌｔ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｓｅｘ　ｗｉｔｈ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ，ｓｔｒｉｄｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｉｔａｌｉａ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ　ｔｈｅ　ｃｏｕｐｌｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｍｕ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　

ｍａｎｙ　ｒｅｐｏｒｔｓ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｓｅｘ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｒｄｓ，ｔｈｅｙ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｓａｙ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｔｈｅｓｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｄａｐｔｅｄ　ｔｏ　ｒａｔｉｔｅ　

ｂｉｒｄｓ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｉｓ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｆａｓｔ，ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｓｅｘ　Ｅｍｕ．　Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｆｅａｔｈｅｒｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｎｏｎｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ｓａｍｐｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ａ　

ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｆｒ０ｍ　１　８　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ．Ｓｅｘ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ　

ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｓｅｘ．ｋｎｏｗｎ　ａｎｄ　ｓｉｘｔｙ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｏｆ　ｓｅｘ．ｕｎｋｎｏｗｎ　Ｅｍｕ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｍａｌｅ　ｂｉｒｄｓ　

ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｚｅｒｏ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂａｎｄ，ｗｈｅｒｅａｓ　ｏｎｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｂａｎｄ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｏｒ　ｅａｃｈ　ｆｅｍａｌｅ　ｏｎｅｓ　

ｉｎ　Ｅｍｕ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　

５３６　ｂｐ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｓｏｌｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂｌｅｍ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｅｘｅｓ　ｏｆ　ｒａｔｉｔｅ　ｂｉｒｄｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｆｉｃｕｌｔ　ｔｏ　ｂｅ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ　

ｂｙ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅ　ａｓ　ｂｏｔｈ　ｍａｌｅ　ａｎｄ　ｆｅｍａｌｅ　ｅｍｕ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｌｏｏｋｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒａｔｉｔｅ　ｂｉｒｄ：Ｅｍｕ；ｓｅｘ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ　

鸟类的性别鉴定对鸟类的饲养管理、繁殖与育　

种、遗传病的诊断与防治、种群结构和群体遗传多　

样性分析等方面都有非常重要的意义，特别是对濒　

危珍稀鸟类的保护和管理具有重要作用【”。目前国　

内主要应用传统的性别鉴定方法［２－５］，而非平胸总目　

鸟类的性别鉴定的分子生物学方法已见报道　，但　平胸鸟类性别鉴定的分子生物学方法只见Ｈｕｙｎｅｎ　

报道。Ｈｕｙｎｅｎ等采用ＲＡＰＤ标记，利用随机引物　

Ｋ．和Ｋ　对现存的平胸鸟类（包括鸵鸟和鸸鹋）进行　

了性别的鉴定，雌性个体得到大约３５０　ｂｐ左右的　

条带［９１，这种方法虽然能够区分平胸鸟类的性别，　

但该标记重复性差，不适合用于大量平胸鸟类的性　

收稿日期：２０１０一Ｏ１一ｏ４　基金项目：黑龙江省教育厅研究生创新基金项目（ＹＳＣＸ２００９—１３８一Ｉ－ＩＫＩ）　作者简介：付晶（１９８１一），女，博士研究生，研究方向为特种经济动物饲养。Ｅ～ｍａｉｌ：ｆｕｊｉｎｇ１９９９＠１６３．ｃｏｍ　通讯作者：白秀娟，教授，博士生导师，研究方向为经济动物生产。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｘｊ６３０３０６＠１６３．ｃｏ

ｍ　・８６・　东北农业大学学报　第４１卷　

别鉴定，并且不明确特异片段的序列组成，对进一　

步探讨平胸总目鸟类的性别分化没有明确的意义。　

到目前为止，通过扩增性别基因特异片段来鉴定平　

胸总目鸟类性别的文献尚未见报道。　

绝大多数鸟类雌性的染色体型为ＺＷ型，而雄　

性为ｚｚ型，与哺乳动物雄性异配型相反㈣。所以　

凡是ｗ染色体上的特异序列或基因便成为人们研　

究的主要对象［１１】。目前用于性别鉴定的性别连锁基　

因主要有ＣＨＤ基因（Ｃｈｒｏｍｏ—ｈｅｌｉｃａｓｅ—ＤＮＡ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｇｅｎｅ）和ＥＥＯ．６（０．６一Ｅｃｏ　Ｒ　Ｉ—ｆｒａｇｍｅｎｔ）。这两段基　因在ｗ染色体上是非常保守的，可以依此对非平　

胸鸟类进行性别鉴定，但不适于平胸鸟类的性别鉴　

定。由于平胸鸟类没有异源的染色体对，ｗ染色体　

上主要是常染色质，与ｚ染色体具有相当高的同源　

性　，根据这一特性利用ＰＣＲ扩增特异性引物可鉴　

定平胸鸟类的性别。因此，本研究采用扩增性别基　

因特异片段方法对平胸鸟类性别进行鉴定。　

１　材料与方法　

１．１材料　鸸鹋样本取自日本北海道网走鸸鹋养殖基地，　

已经通过繁殖证实性别的鸸鹋６只（３雌３雄）。另　有６０只未知性别的鸸鹋待测。　

１．２试剂　

基因组提取试剂、ＰＣＲ试剂和克隆测序试剂均　购自北京天根生物工程公司。　

１．３方法　

１．３．１基因组ＤＮＡ的提取　

按照霍明东等【　３１方法将鸸鹋的羽毛剪碎放人１．５　

ｍＬ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，再依次加入５５０　ＩＬＬ组织裂解　

液（４５５　ＩＸＬ　ｌｘＳＥＴ液＋２５　ＩＸＬ　１０％ＳＤＳ），２０　ＩＸＬ蛋白　

酶Ｋ，混匀。５５℃空气浴振荡过夜后，用苯酚一氯　

仿萃取法提取ＤＮＡ。并溶于ＴＥ中，－２０　ｏ【＝保存网。用　

琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测ＤＮＡ的　

纯度和浓度，然后根据ＯＤ值稀释成５０ｎｇ・　Ｌ－１，４　ｏＣ　

保存备用。　

１＿３．２引物　

利用国内外文献报道的鸟类性别鉴定的通用引　

物进行多种组合，最后从ＥＥＯ．６（０．６一Ｅｃｏ　Ｒ　Ｉ—ｆｌａｇ—　

ｍｅｎｔ）和ＣＨＤ基因（Ｃｈｒｏｍｏ—ｈｅｌｉｅａｓｅ—ＤＮＡ—ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｇｅｎｅ）中各筛选出１条引物来组合进行扩增，从而　

鉴定鸸鹋的性别将这对引物称作有效引物。并用　

，Ｐ　这对引物来鉴定雄性鸸鹋基因组的有效性，将　

这对引物称作验证引物。引物序列见表１。　

表１引物序列　

Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　

１．３．３　ＰＣＲ扩增　ＰＣＲ体系：扩增总体积为２５　Ｌ，其中灭菌水　

１４．２　ＩＬＬ、１０ｘｂｕｆｆｅｒ　２．５　ＩＸＬ、ｄＮＴＰ（１０　ｍｍｏ］・Ｌ。）２．０　Ｌ、上下游引物（１０　ｐｍｏｌ・ＩＪ＿　）各１　ＩＸＬ、ｒ　聚合酶　

０．３　Ｌ、镁离子１　ＩＸＬ、ＤＮＡ模板３　Ｌ。做阴性对　

照的ＰＣＲ体系中模板不加，除灭菌水以外的其他物　

质均按上述量添加，最终用灭菌水将总体积补充至　

２５　Ｌ。扩增反应在ＰＴＣ一２００型ＰＣＲ仪上进行。　有效引物扩增程序：９４℃预变性５　ｍｉｎ，９４℃　

变性３０　Ｓ，退火４７．０　ｏＣ　３０　Ｓ，７２　ｃｃ延伸１ｍｉｎ，循　

环３３次，７２℃延伸１０　ｍｉｎ，产物经２％琼脂糖凝　胶电泳鉴定。　

验证引物扩增程序：９４℃预变性５　ｍｉｎ，９４℃　

变性３０　Ｓ，退火４０．５℃４０　ｓ，７２　ｏＣ延伸４０　Ｓ，循　环３０次，７２℃延伸８　ｍｉｎ，产物经２％琼脂糖凝胶　

电泳鉴定。　

１．３．４验证试验　

由于有效引物的扩增结果中雄性鸸鹋没有扩增　

出条带，一方面原因可能是该引物组合对ｗ染色　

体上的特异性片段进行扩增，雄性不扩增，因此雌　

性会产生１条扩增带；另一方面如果有其他因素　

（如模板降解）

导致ＰＣＲ反应失败，则很可能造成　第６期　付晶等：鸸鹋性别鉴定的分子标记方法　

性别误判。因此，为了证明雄性鸸鹋的基因组质量　

合格，可以用于ＰＣＲ扩增，本试验增加了验证引　

物（该引物对雌性和雄性鸸鹋均能扩增出条带）对已　

知性别鸸鹋的基因组进行扩增的试验。　

１．３．５特异引物扩增产物的克隆测序　

参见于迪等【　４１方法对特异性引物扩增产物进行　

克隆，提取的质粒经鉴定确认后邮递到北京华大生　

物技术有限公司测序。　

２结果与分析　

２．１　ＰＣＲ产物电泳结果　

２．１．１有效引物对已知性别鸸鹋鉴定　

利用该有效引物组合，从已知性别的鸸鹋的　基因组ＤＮＡ中扩增出相应的片段，结果见图１。１　

号是阴性对照，２～４号是雄性鸸鹋，无特异性的条　

带出现；５－７号是雌性鸸鹋，分别扩增出一条约为　

５６０　ｂｐ左右的特异性条带。此结果证明，这对有　

效引物能鉴别鸸鹋的性别，可用于鸸鹋的性别鉴　

定。　

２ｏｏｏ　１Ｏ０ｏ　５０ｏ　２５０　１００　２０００　ｂｐ—＇　１０００　ｂｐ—　５００　ｂｐ—　２５０　ｂｐ—’　１００　ｂｐ—’　

Ｍ—ＤＬ２０００　ＤＮＡ分子质量标准；２－４一雄性；５—７一雌性；１－阴性对照　Ｍ—ＤＬ２０００　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；２—４一Ｍａｌｅ；５—７一Ｆｅｍａ１ｅ；１－Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　图１有效引物对已知性别鸸鹋ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增　

Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｉｎ　ｓｅｘ－ｋｎｏｗｎ　

２．１．２有效引物对未知性别鸸鹋的鉴定　

用该有效引物组合扩增鉴定未知性别的鸸鹋６０　

只，鉴定结果为雄性鸸鹋４Ｏ只，雌性鸸鹋２０只。　

部分扩增结果见图２。１号是阴性对照，２、５、６、　

８、９、１０、１４、１６、１７号是雄性鸸鹋，无特异性的　

条带出现；３、４、７、１１、１２、１３号是雌性鸸鹋分　

别扩增出一条约为５６０　ｂｐ左右的特异性条带，其中