重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定共38页文档

重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。

5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。

7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。

8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。

并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。

9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。

10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。

【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。

重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。

将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。

其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。

转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。

再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。

因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。

一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。

2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。

3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。

4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。

二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。

（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。

（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。

2、根据报告基因筛选转化子。

（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。

由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。

（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。

如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。

3、根据形成噬菌斑筛选转化子。

基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。

分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。

不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。

）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。

不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。

7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。

（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。

这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

3、足够多的载体和插入片段是最重要的。

4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。

这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

重组子鉴定的方法重组子鉴定（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）是一种用于确定DNA分子的特定区域中是否存在多态性的方法。

该方法基于DNA 序列中存在的限制性内切酶切位点差异，通过对DNA片段进行限制性内切酶切割并进行凝胶电泳分离，最终得到一系列特定长度的DNA片段模式。

重组子鉴定的基本步骤如下：1. DNA提取：从待测样本（如血液、口腔黏膜等）中提取总DNA。

2. DNA限制性内切酶切割：选择适当的限制性内切酶，将DNA样本切割成多个片段。

限制性内切酶通常会识别并切割具有特定序列的DNA片段。

切割位点的选择非常重要，因为它决定了所产生的DNA片段的长度差异。

3. 凝胶电泳分离：将切割后的DNA片段加入到凝胶中进行电泳分离。

电泳过程中，DNA片段会根据其大小在凝胶上移动，从而形成不同的DNA片段模式。

通过与分子量标尺进行比较，可以确定电泳图谱上的每个片段的大小。

4. 转移和杂交：将凝胶中分离出的DNA片段转移到一个固体支持物（如尼龙膜）上，然后进行杂交。

杂交是将具有已知序列的DNA探针与待测样本中的DNA 片段进行结合的过程。

探针是通过特殊标记的DNA片段，可以与待测样本中的特定片段互补结合。

通过杂交过程，可以确定某个特定的DNA片段是否存在于待测样本中。

5. 清洗和检测：将未与待测样本中的DNA结合的探针洗去，并采用合适的检测方法检测探针与待测样本中的DNA结合情况。

常用的检测方法包括放射性标记、荧光标记和酶标记等。

重组子鉴定的优点在于其较高的分辨率和多态性。

然而，该方法在实践中也存在一些限制因素。

其中包括限制性内切酶的选择性受限、需大量DNA样本和耗时等。

此外，在进行杂交过程中，还需要具备足够的探针密度和适当的杂交条件，以确保准确性和可靠性。

最近，随着分子生物学和遗传学领域的发展，重组子鉴定已经逐渐被其他更高效、更灵敏的技术所取代。